[发明专利]一套纳米生物靶向诊断反应器检测GP73、Nrp1、Frz肿瘤标志物方法及应用

说明书

本发明公开一套纳米生物靶向诊断反应器检测GP73、Nrp1、Frz肿瘤标志物方法及应用，属于基因工程、免疫学和肿瘤学技术领域。这是一种采用基于纳米金探针的酶联免疫吸附试验用于抗GP73、NRP1、Frz抗体高灵敏检测的信号放大策略，本探针由HRP酶标记的羊抗人IgG抗体高负载于纳米金表面形成，且稳定性好，易制备。在检测进程中，首先利用基因工程菌表达纯化可溶性肝细胞癌相关抗原GP73、NRP1、Frz，并以此蛋白作为抗原，分别检测肝细胞癌、肝炎、肝硬化、肝良性肿瘤及正常人血清中抗GP73、NRP1、Frz抗体的水平。在肿瘤诊断、肿瘤预后与监测的评估中具有较广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程、免疫学和肿瘤学技术领域，特别涉及一套纳米生物靶向诊断反应器检测GP73、Nrp1、Frz肿瘤标志物的方法及应用。

背景技术

目前，血清学肝癌标志物检查、计算机断层扫描及核磁成像、超声等是诊断肝癌的几种传统方法。其中，临床最常见肝癌标志物之一AFP的血清浓度检测是诊断肝癌常规方法之一，并且广泛应用于肝癌治疗监测和复发预测。然而，其诊断肝癌的灵敏性与肿瘤的大小相关---肿瘤直径小于3 cm的灵敏度仅为25%，而肿瘤直径大于3 cm的诊断灵敏度可达到50%。一方面，如此低的灵敏度无法提高肝癌的早期诊断。另一方面，几种肝癌标志物联合诊断能大大提高肝癌的诊断率。因此，筛选新的肝癌标志物以提高肝癌的早期诊断率迫在眉睫。

近年来，科学家们发现的肿瘤标志物高尔基体蛋白73（Golgi protein-73, GP73）是一种存在于高尔基体的跨膜糖蛋白。GP73 主要表达于人类多种组织的上皮细胞，正常肝脏组织表达甚微，但在发生病变的肝细胞中表达上调，它的上调可能与肝癌有着非常密切的关系。研究表明，GP73 诊断肝癌的敏感度和特异性分别为83.3%和88.3%，明显均优于AFP，尤其是在AFP 阴性的肝癌患者中，大部分患者血清中GP73 水平阳性，且血清GP73 和AFP 的表达水平之间无显著相关性。将GP73 和AFP 联合进行检测时，对肝癌的敏感度可提高到94.4%。因此，GP73被认为是近年来发现的最有价值的肝癌标志物，有可能成为更好的诊断肝癌（尤其是早期肝癌）的血清标志物。

神经菌毛素-1(neuropilin-1，NRP1)于1997年首次被鉴定为神经导向因子3A的共受体，与神经丛素3A共同调节神经轴突的生长。随后的研究显示，NRP1参与调节恶性肿瘤细胞的存活、增殖、侵袭和迁移，是多种恶性肿瘤的不良预后因素。

卷曲蛋白（FRZ）最初鉴定于果蝇，因其与无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点家族（WNT）缠绕在一起而得名，是WNT家族的细胞表面受体，包括三个区域，是G蛋白偶联受体（GPCR）家族中的一员，具有和缺失GPCR的一些基本结构。FRZ信号转导通路分为依赖转录调节因子β-连环蛋白的经典和非经典信号转导通路。FRZ包括FRZ1～10，其调节作用非常广泛，不但在细胞水平上参与调控胚胎发育、干细胞分化和器官形成等过程，而且还在维持组织稳态、再生、塑性和修复中起着重要的作用。

纳米技术是一个专注于纳米级材料和设备的研究和应用的领域，并广泛的应用于生物医学。纳米技术靶向诊治疾病是一种理想的方法，并正在向临床转化。纳米材料在三维空间中至少有一维处于纳米尺寸范围。已接近光的波长的尺度与较大的表面积使其表现出特有的性质。纳米材料的应用大大促进了疾病的诊断与治疗。其中，纳米金是使用最广泛的材料之一，由于它容易被许多分子如蛋白，核酸等修饰的特性。纳米金与这些具有靶向能力的分子连接后不仅能够稳定分子，而且还能够增强靶向性。抗体作为最常见的靶向试剂之一与纳米金连接形成检测探针已应用于多种物质的检测。并且纳米金有过氧化物酶性质，且比表面积大，分散性好，是一个较好的信号放大载体。因此，研究一套纳米生物靶向诊断反应器检测GP73、Nrp1、Frz肿瘤标志物的方法及应用，是本领域技术人员亟待解决的难题。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一套纳米生物靶向诊断反应器检测GP73、Nrp1、Frz肿瘤标志物的方法及应用。