[发明专利]mir-124和HER2-shRNA双基因表达盒病毒载体、构建方法、病毒、应用

权利要求书

1.一种mir-124和HER2-shRNA双基因表达盒慢病毒载体，其特征在于，包括在慢病毒表达载体中整合连接mir-124序列和HER2-shRNA序列构建而成；其中mir-124序列如SEQ IDNO.1所示，HER2-shRNA序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的mir-124和HER2-shRNA双基因表达盒慢病毒载体，其特征在于，所述病毒表达载体为慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro载体质粒。

3.一种如权利要求2所述的 mir-124和HER2-shRNA双基因表达盒慢病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

1）人工合成mir-124序列和HER2-shRNA序列；

2）对步骤1）人工合成的mir-124序列和HER2-shRNA序列分别进行PCR扩增；

3）将步骤2）的PCR扩增产物和慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro分别进行酶切；

4）将步骤3）的酶切产物进行连接，得重组慢病毒载体；

5）将步骤4）的重组慢病毒载体进行测序和比对，比对序列和表达行为正确的重组慢病毒载体即为构建成功的 mir-124和HER2-shRNA双基因表达盒病毒载体。

4.如权利要求3所述的mir-124和HER2-shRNA双基因表达盒慢病毒载体的构建方法，其特征在于，步骤2）中mir-124序列的扩增引物序列为：

mir124-F：GAATTCCTGTGTGATTGGGGGAGCTG；

mir124-R：GCGGCCGCCTCTAAGCCCCTGTCTGTCAC；

HER2-shRNA序列的扩增引物序列为：

HER2shRNA-F：GCGGCCGCGGATCCGAATTCTGCGG

HER2shRNA-R：GCGGCCGCCTATTAATAACTAATGC。

5.如权利要求3所述的mir-124和HER2-shRNA双基因表达盒慢病毒载体的构建方法，其特征在于，步骤5）中对重组慢病毒载体进行测序和比对的具体方法为：将步骤4）获得的重组慢病毒载体转化DH5α感受态细胞，并进行PCR鉴定，对PCR鉴定的阳性克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的mir-124和HER2-shRNA双基因表达盒病毒载体；

其中PCR鉴定过程中使用的引物序列为：

CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG；

EF1-R：CGCCACCTTCTCTAGGCAC。

6.一种慢病毒，其特征在于，采用如权利要求2所述的mir-124和HER2-shRNA双基因表达盒慢病毒载体构建而成。

7.如权利要求6所述的慢病毒，其特征在于，采用慢病毒包装质粒pRSV-Rev、pMDLg-pRRE和Pmd2.G对mir-124和HER2-shRNA双基因表达盒病毒载体进行包装，通过转染HEK293细胞，构建制得mir-124和HER2-shRNA双基因表达盒慢病毒。

8.一种如权利要求6所述的慢病毒在制备预防和治疗HER2阳性肿瘤药物方面的应用。