[发明专利]一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法

说明书

为解决猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化中的步骤复杂、工艺繁琐、生产成本高、纯化效率低等问题，本发明提供了一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法，包括如下步骤：步骤S1，收集重组酵母细胞并进行破碎，获得含猪圆环病毒2型病毒样颗粒的细胞裂解液；步骤S2，对细胞裂解液进行澄清获得病毒样颗粒初提液；步骤S3，对病毒样颗粒初提液进行离子交换层析获得病毒样颗粒粗纯液；步骤S4，对病毒样颗粒粗纯液进行超滤浓缩获得病毒样颗粒浓缩液；步骤S5，对病毒样颗粒浓缩液进行凝胶过滤层析纯化，获得纯化后的病毒样颗粒，其中，步骤S3的离子交换层析中，吸附过程及洗脱过程中所采用的缓冲液均含有预定浓度的表面活性剂。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及病毒样颗粒的分离纯化方法，具体涉及一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的分离纯化方法。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是属于圆环病毒科(Circoviridae)、圆环病毒属(Circovirus)的DNA病毒，其核酸分子为单股、首尾闭合的环状结构，无囊膜。PCV2本身不致死猪，但可造成免疫抑制。PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原，当与其它病原混合感染时，可加重病猪的死亡，给养殖业带来巨大的损失。PCV2已成为危害养猪业的主要疫病之一，在猪群中感染率较高，疫苗是防控PCV2的有效工具，免疫接种可以减少PCV2对免疫猪的危害程度及其组织病毒载量，也为猪场进行PCV2的净化提供了基础条件。目前市场上的PCV2商品化疫苗主要有全病毒灭活苗和亚单位疫苗两种：全病毒灭活苗方面，由于病毒自身特点和生产工艺的弊端，经常出现病毒滴度难以提高等技术问题，且其有效抗原纯度较低，免疫接种后经常出现不同程度的不良反应。

猪圆环病毒亚单位疫苗主要是使用真核或原核表达系统高效表达Cap蛋白，Cap蛋白经自组装形成病毒样颗粒(Virus-like Particle，VLP)，经纯化后可制备病毒样颗粒疫苗。VLP的形态结构与天然病毒高度相似，免疫原性良好，且不含有病毒基因，因此是一种理想的疫苗形式。目前，大多数商用PCV2亚单位疫苗使用昆虫杆状病毒表达系统表达重组Cap蛋白，但该系统表达时间长且成本昂贵；而大肠杆菌等原核表达系统不能对重组蛋白进行翻译后修饰，且需要考虑内毒素的去除。酵母细胞是比原核生物更好的表达系统，不仅能解决原核系统的内毒素问题，还可对表达的蛋白进行糖基化修饰，表达水平高，易于放大，且相较于其他真核表达系统成本更为低廉。

基于上述原因，本发明的发明人构建了重组表达猪圆环病毒2型病毒样颗粒(即PCV2VLPs)的马克斯克鲁维酵母，并针对重组获得的菌株申请了发明专利(即CN201610806538.0)。然而，发明人在进行该重组酵母的提取纯化研究时发现，现有技术中病毒样颗粒的纯化方法常采用沉淀法、梯度离心、阴离子交换层析和分子排阻层析等，存在步骤复杂、工艺繁琐、生产成本高、纯化效率低等诸多问题。

发明内容

为解决上述问题，本发明的发明人首先进行了PCV2Cap蛋白的序列分析，发现在PCV2Cap蛋白的234个氨基酸中，有强碱性氨基酸精氨酸、赖氨酸和组氨酸的残基数达41个，而强酸性氨基酸天冬氨酸和谷氨酸的残基数仅16个，PCV2cap蛋白的理论等电点约为10.8，因此在常规的纯化缓冲体系(pH6-8)中PCV2VLPs表面极有可能是带正电荷。因此，采用阳离子交换层析可以较好地分离出PCV2VLPs。

此外，酵母细胞在高压破碎的过程中，细胞内的多糖类等带负电的物质大量释放，可能与PCV2VLPs通过离子作用结合到一起，中和了PCV2VLP表面的正电荷，影响阳离子交换层析分离纯化PCV2VLP的效率，因此，在进行阳离子交换层析过程中，通过补加特定的表面活性剂，同时增强缓冲体系中的离子强度，就能够显著提高PCV2VLP的纯化效率。

经过以上分析，为达到建立高效的PCV2VLPs纯化工艺的目的，发明人在本发明中提出了基于阳离子交换层析并在阳离子交换层析中补加特定的表面活性剂的分离纯化方法。具体地，本发明采用了如下技术方案：