[发明专利]一种将成纤维细胞体外重编为Sertoli细胞的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种将成纤维细胞体外重编为Sertoli细胞的方法及其应用。该方法包括如下步骤：向成纤维细胞中导入在Sertoli细胞中特异表达的荧光蛋白报告系统；再导入提高NR5A1蛋白的表达量和/或活性的物质；加入G418，培养3‑7d；弃液相，加入用于培养成纤维细胞的培养基，继续培养3‑7d；从培养体系中分离Sertoli细胞。实验证明，采用上述方法制备的细胞完全获得了Sertoli细胞的特征，如具有吸引内皮细胞、形成脂滴、与生殖细胞互作、抑制淋巴细胞的生长及白细胞介素的产生、免疫豁免能力等特性。本发明在不孕不育的治疗、异体移植和细胞治疗等领域具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种将成纤维细胞体外重编为Sertoli细胞的方法及其应用。

背景技术

根据世界卫生组织的统计，不孕不育困扰着世界上15％左右的夫妇。其中，男性因素占据40％-60％的比重，具体反映在精细胞数量或者质量的缺陷上。人类多能性干细胞，具有分化为人体各种细胞类型的潜力。体外分化干细胞为有功能的精细胞，为不孕不育的治疗提供了一种切实可行的途径。

Sertoli细胞是睾丸体细胞的一种，与生殖细胞一起存在于生精小管中，对精子发生的触发和调控具有举足轻重的作用。对于精子体外分化体系的构建，Sertoli细胞将是不可或缺的组成成分。此外，睾丸中的Sertoli细胞还演化出了特殊的免疫豁免属性，可以保护生殖细胞免遭免疫系统的攻击。Sertoli细胞的这个特性已被应用于细胞、组织、器官异体移植等治疗领域，用以减轻宿主对移植细胞的免疫排斥，从而提高细胞的存活率。另外，Sertoli细胞本身还可以用作基因工程细胞，用于携带和表达特定的治疗蛋白或者药物。由此可见，Sertoli细胞是一种非常有应用潜力的细胞；但受来源和伦理等的制约，从人体内大规模获取Sertoli细胞也并不现实。

成纤维细胞是动物结缔组织中常见的细胞，可从动物个体获取。在细胞谱系重编程研究中，成纤维细胞常被用作起始细胞；然而，目前还没有成纤维细胞体外重编为Sertoli细胞的相关报道。

发明内容

本发明的目的是制备Sertoli细胞。

本发明首先提供了一种制备Sertoli细胞的方法，可包括步骤a2)：增加成纤维细胞中NR5A1蛋白的表达量和/或活性。

上述方法中，所述“增加成纤维细胞中NR5A1蛋白的表达量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到增加成纤维细胞中NR5A1蛋白的表达量和/或活性的效果。

上述方法中，所述“增加成纤维细胞中NR5A1蛋白的表达量和/或活性”可为向成纤维细胞中导入提高NR5A1蛋白的表达量和/或活性的物质。

上述方法中，所述“向成纤维细胞中导入提高NR5A1蛋白表达量和/或活性的物质”可通过向成纤维细胞中导入编码NR5A1蛋白的核酸分子(即NR5A1基因)实现。所述“向成纤维细胞中导入编码NR5A1蛋白的核酸分子”具体可通过慢病毒侵染成纤维细胞实现；所述慢病毒可表达NR5A1蛋白。

在本发明的一个实施例中，所述慢病毒可为重组慢病毒a(表达NR5A1蛋白)。所述重组慢病毒a可为慢病毒载体a包装而成。具体的，可将慢病毒载体a、帮助质粒vsvg和慢病毒载体包装质粒pCMVΔR8.9共转染293FT细胞，获得重组慢病毒a。所述慢病毒载体a的制备方法可为：向pENTR/1A质粒的多克隆位点(如限制性内切酶EcoRI)插入NR5A1基因，得到载体pENTR/1A-NR5A1；向pENTR/5’topo质粒的多克隆位点(如限制性内切酶EcoRI)插入序列表中序列2所示的双链DNA分子(EF1α启动子的核苷酸序列)，得到载体pENTR/5’topo-EF1α；所述载体pENTR/1A-NR5A1、所述载体pENTR/5’topo-EF1α和慢病毒质粒p2K7-NEO，通过同源重组制备慢病毒载体a。