[发明专利]一种运用RNAi有效防治鳞翅目害虫的方法

说明书

本发明公开了一种运用RNAi有效防治鳞翅目害虫的方法。该方法通过饲喂的方式将针对法尼醇脱氢酶FOLD、保幼激素甲基转移酶JHAMT、保幼激素环氧酶CYP15C1相关基因的双链RNA(即dsRNA)导入到幼虫体内，实现防治鳞翅目害虫的目的；本发明方法用于防治鳞翅目害虫，防治特异性强，防治效果持久，安全，对哺乳动物等无害。

技术领域

本发明涉及生物防治技术领域，具体的说，涉及一种运用RNAi有效防治鳞翅目害虫的方法。

背景技术

鳞翅目昆虫，主要包括蛾、蝶两类昆虫。全世界已知约20万种，中国已知约8000余种。其中蛾类6000种，蝶类2000种。同时也是农、林害虫最多的一个目。绝大多数种类的幼虫为害各类栽培植物，体形较大者常食尽植物叶片或钻蛀枝干。体形较小者往往卷叶、缀叶、结鞘、吐丝结网或钻入植物组织取食为害。鳞翅目幼虫绝大多数为陆生，多为植食性，是一种广泛分布于全球的害虫。目前主要通过物理诱杀和化学杀虫剂进行防治，效果均有限，且杀虫剂的施用很可能带来生物安全性问题和抗性的产生，亟需发现新方法。

RNA干扰技术近年来发展迅速，利用dsRNA对基因表达水平进行下调很可能成为害虫防治的新手段。RNA干扰的成功与否主要取决于靶基因的选择，目前对昆虫的研究主要集中在神经、代谢以及生殖发育相关酶类，对于保幼激素合成的研究还较少。保幼激素作为调节昆虫生长发育的重要激素，其生物合成中涉及的酶类具有作为RNAi靶标的潜力。

发明内容

本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种运用RNAi有效防治鳞翅目害虫的方法，其以保幼激素生物合成相关酶基因作为RNAi靶标，抑制害虫保幼激素的合成，调控鳞翅目害虫生长发育。

本发明的实现方式为，用RNAi有效防治鳞翅目害虫的方法，利用饲喂的方式将针对法尼醇脱氢酶FOLD、保幼激素甲基转移酶JHAMT、保幼激素环氧酶CYP15C1相关基因的双链RNA导入到鳞翅目害虫体内，抑制其相关酶的表达，抑制保幼激素合成，导致幼虫的死亡，达到防治鳞翅目害虫的目的。本发明的技术方案具体介绍如下。

一种运用RNAi有效防治鳞翅目害虫的方法，通过饲喂的方式将针对法尼醇脱氢酶FOLD、保幼激素甲基转移酶JHAMT、保幼激素环氧酶CYP15C1相关基因的双链RNA导入到幼虫体内，实现防治鳞翅目害虫的目的；其中：针对法尼醇脱氢酶FOLD、保幼激素甲基转移酶JHAMT、保幼激素环氧酶CYP15C1相关基因的双链RNA的合成步骤如下：

(1)提取总RNA，反转录全部mRNA为cDNA，根据已知的鳞翅目害虫的FOLD、JHAMT和CYP15C1基因设计特异性引物，引物均添加T7启动子，PCR扩增特异片段，利用琼脂糖凝胶电泳对引物进行验证；

(2)以咽侧体cDNA作为扩增的模板，这些碎片再一次进行克隆放大，dsRNA(法尼醇脱氢酶FOLD、保幼激素甲基转移酶JHAMT、保幼激素环氧酶CYP15C1基因的双链RNA)的合成与纯化采用MEGA script RNAi试剂盒，扩增产物进行消化反应以去除混有的模板DNA和单链RNA；

(3)解剖鳞翅目害虫的幼虫，取出咽侧体，进行RNA提取，完成后续反转录步骤，采用q-RT-PCR检测表达水平，实现dsRNA的体外培养。

本发明中，步骤(1)中，扩增FOLD基因片段的上游引物的序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:2所示；扩增JHAMT基因片段的上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示；扩增CYP15C1基因片段的上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示。

本发明中，饲喂时，法尼醇脱氢酶FOLD、保幼激素甲基转移酶JHAMT、保幼激素环氧酶CYP15C1基因的双链RNA和食物总重量的投料比分别在2.5～3.5mg/g之间。