[发明专利]合成致新生儿脑膜炎大肠杆菌糖蛋白结合疫苗的大肠杆菌工程菌及用途

说明书

本发明公开了一种合成致新生儿脑膜炎大肠杆菌糖蛋白结合疫苗的大肠杆菌工程菌及用途。涉及构建合成致新生婴儿脑膜炎大肠杆菌O1血清型糖蛋白结合疫苗细胞工厂的方法。它是利用酿酒酵母高效的同源重组效率，基于DNA Assembler的方法，构建O1抗原合成基因簇质粒。在大肠杆菌JM109中转化O1抗原合成基因簇穿梭质粒，通过脂多糖提取，凝胶电泳和银染鉴定质粒；在FLP‑FRT辅助下删除JM109中的waaL和wecA，排除原始不完整O抗原的干扰。改造pET28a(+)质粒，经诱导，合成糖蛋白结合疫苗，借助于AKTA Primeplus蛋白纯化工作站纯化糖蛋白并通过western‑blotting鉴定该糖蛋白。本发明构建的重组大肠杆菌为生物法合成糖蛋白结合疫苗提供了新的思路。

技术领域

本发明属于合成生物学技术领域，涉及一种利用重组大肠杆菌合成致新生儿脑膜炎大肠杆菌糖蛋白结合疫苗的方法。更具体地说是一种合成致新生儿脑膜炎大肠杆菌糖蛋白结合疫苗的大肠杆菌工程菌及用途。

背景技术

新生儿致脑膜炎大肠杆菌（NMEC）是隶属于肠外致病性大肠杆菌的一大类群，主要侵染对象为新生婴幼儿和免疫力低下的人群，属于条件致病菌。经由胃肠道或呼吸道黏膜定植后，NMEC可侵入血液循环系统并大量繁殖，形成高浓度的菌血症。菌血症浓度达到一定阈值后，NMEC将进入脑部侵染环节。通过表达多种特异毒力因子来抵御宿主免疫系统攻击，NMEC可以穿越人体血脑屏障，进入脑脊液和脑组织繁殖生长，并引发严重的脑膜炎和无法痊愈的后遗症。与禽致病性大肠杆菌和尿路致病性大肠杆菌引发的疾病相比，NMEC感染的高致死率和高治疗难度一直是临床医学研究的难题之一。NMEC耐受环境压力，分布广泛，加之近年来出现的多重耐药性，使得NMEC的预防和治疗面临巨大的困难。接种相应疫苗是对抗NMEC感染的有效手段。目前，对新生儿致脑膜炎大肠杆菌致病菌的疫苗研制较少。本发明提供了一种针对特殊病原菌更为简单方便的疫苗生产策略，为生产多糖蛋白结合疫苗提供了新的途径。

发明内容

为实现上述目的，本发明公开了一种合成致新生儿脑膜炎大肠杆菌糖蛋白结合疫苗的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，含有NMEC不同血清型O抗原合成基因簇质粒和糖基化系统质粒，同时删除了waaL和wecA基因，命名为工程菌株JM109∆waaL。所述的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述含有NMEC血清型O1抗原合成基因簇质粒，是指通过BSPdb数据库定位出其O抗原合成基因簇区域，并将其连接到酿酒酵母-大肠杆菌穿梭载体pCRG16上。该载体分别能够在大肠杆菌和酿酒酵母中稳定复制表达，同时含有合成O1重复单元的基因，以及将重复单元聚合起来的聚合酶和翻转酶。其鉴定方法如下：将该载体导入JM109中，得JM109/pCRG16-O1，提取LPS，通过凝胶电泳和银染图谱鉴定质粒的正确性。该质粒图谱见图1.。

本发明所述含有糖基化系统质粒，指的是：改造pET28a(+)，插入合成的两对tac启动子和rrnB终止子替换原始的T7启动子和终止子，该质粒含有来自于铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）经过大肠杆菌密码子优化的外毒素A基因（exotoxin A，GI：877850）；和来自空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）并经过大肠杆菌密码子优化的N-糖基转移酶编码基因（undecaprenyl-diphosphooligosaccharide--proteinglycotransferase，GI：905417），该条目中的两个基因分别处于一对tac启动子和rrnB终止子控制下，该质粒命名pET28M-epa-pglB。质粒图谱见图2.。

本发明进一步公开了合成致新生儿脑膜炎大肠杆菌糖蛋白结合疫苗的大肠杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下：

1）将质粒pSim导入转化到宿主菌JM109中，获得携带质粒的宿主菌；