[发明专利]一种全基因组杂交克隆方法

说明书

一种用于生物领域的全基因组杂交克隆方法，其特征在于，以鼠sp2/0细胞替换传统基因克隆中所用的基因载体及感受态细胞，将欲作全基因组克隆的细胞与能无限繁殖的sp2/0细胞混合，以0.25％胰蛋白酶和II型胶原酶混合液消化，然后经PEG作用，两亲代细胞依次发生胞膜、胞浆、胞核、染色体及基因组的融合杂交，经HAT筛选而获得既具有待克隆基因组又能无限繁殖的继承了两亲代细胞遗传物质的杂交细胞，即传统基因克隆中的感受态细胞，使杂交细胞中的全基因组随着杂交细胞的无限繁殖而克隆，解决了只能克隆短片段DNA而不能同步克隆细胞内全基因组的传统基因克隆技术所不能解决的问题。

技术领域

本发明公开了一种用于生物领域的全基因组杂交克隆方法，主要应用于细胞内全基因组的同步克隆扩增。

背景技术

基因克隆是70年代发明的具有革命性的技术，基因克隆又称为DNA重组，是将目的基因与具有自主复制能力的载体DNA在体外连接，构建重组DNA，然后导入受体细胞，进行目的基因阳性受体细胞的筛选和无性繁殖。

基因克隆由P.Berg等发明创建，1972年P.Berg等把一种猿猴病毒的DNA与噬菌体DNA用同一种限制性内切酶切割后，再用DNA连接酶把这两种DNA分子连接起来，构成一种新的重组DNA分子。1973年S.Cohen等把一段外源DNA片段与质粒DNA连接起来，构成了一个重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌中复制，第一次建立了完整的基因克隆体系。基因克隆从发明到现在经历了三个发展阶段，第一个阶段是至今仍被广泛应用的20世纪70年代初需要限制性内切酶和连接酶的经典基因克隆技术的创建。第二个阶段是20世纪90年代初不依赖连接酶的克隆方法的出现，这种方法不需要连接酶的参与，不受限制性内切酶的限制，使得基因克隆更加灵活。第三个阶段是21世纪初重组酶被运用到基因克隆中，使基因克隆靶向性更强，操作更简便。

基因克隆可概括为“分、切、连、转、选”步骤，最终目的是将目的基因导入宿主细胞，并在宿主细胞内大量复制。其中“分”是指分离制备合格的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的DNA，这些DNA分子或来自目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链cDNA分子；“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA或者切出目的基因，由于基因组DNA较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化，若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因；“连”是指用DNA连接酶将目的DNA和载体DNA连接起来，形成重组的DNA分子；“转”是指通过特殊的方法将重组的DNA分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；“选”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的个体。按基因克隆的操作步骤，需要进行①DNA或RNA提取；②DNA的PCR扩增或RNA的cDNA逆转录PCR扩增；③PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳及琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化回收；④回收的DNA以限制性片段长度内切酶酶切；⑤T4 DNA连接酶连接经酶切的DNA和载体，构建重组DNA；⑥重组DNA转化感受态大肠杆菌，并进行阳性菌落筛选；⑦所筛选的阳性克隆的培养及PCR等检测鉴定。

综上可知，传统的基因克隆技术存在以下问题：①涉及PCR仪等多种高档设备，对设备要求高；②涉及多种实验试剂，试剂成本高；③操作繁杂、技术要求高；④特别是只能克隆短片段的DNA，无法克隆较长片段的DNA分子，无法同步克隆细胞水平的全基因组。

发明内容

为了解决传统基因克隆技术所不能解决的问题，本发明人提出了本发明。

本发明的目的是要提供一种全基因组杂交克隆方法。