[发明专利]一种用于检测尖孢镰刀菌的核苷酸序列组、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种用于检测尖孢镰刀菌的核苷酸序列组，包括以SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物，以及还可以包括如SEQ ID No.4所示的荧光探针，该对引物所基于的序列高度保守、高度特异性，可选择性地扩增尖孢镰刀菌，从而将其与常见的同镰刀菌属其它菌种分离开来。基于该对引物的试剂盒和PCR检测方法，具有较高的特异性、灵敏性和操作便利性。

技术领域

本发明涉及一种基因工程技术领域，尤其涉及一种用于检测尖孢镰刀菌的核苷酸序列组、试剂盒及方法。

背景技术

尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)是一类既可侵染植物、又可在土壤中生存的兼性寄生真菌。该病原菌从根部危害植物，引起维管束病害，造成植株枯死，在植株的整个生育期均可发生。对于由真菌引起的植物病害，以前的鉴别方法通常是通过田间观察发病植株、平板分离病原菌、免疫学检测和鉴定，这些方法不仅耗时长，效率和灵敏度较低，而且经验性强。

近年来，分子生物学技术的发展为微生物的准确检测和定量提供了方便，而不再依赖于平板培养等传统技术。实时荧光定量PCR技术是一种方便、快速、准确的非细菌培养的定量方法，指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，然后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的一种方法。

尖孢镰刀菌与其它镰刀属菌种有着较高的同源性，如禾谷镰刀菌、串珠镰刀菌、三线镰刀菌，为实现PCR反应的高度特异性，需要选择高度保守、特异的序列作为耙序列。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供高特异性的用于检测尖孢镰刀菌的核苷酸序列组。

本发明的目的之二在于提供一种用于检测尖孢镰刀菌的试剂盒。

本发明的目的之三在于提供一种用于检测尖孢镰刀菌的方法。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种用于检测尖孢镰刀菌的核苷酸序列组，包括以SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物。

进一步地，还包括如序列表SEQ ID No.4所示的探针，所述探针为荧光标记探针。

进一步地，所述探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。

本发明的目的之二采用如下技术方案实现：

一种用于检测尖孢镰刀菌的试剂盒，包括如SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQID No.3所示的下游引物和如序列表SEQ ID No.4所示的探针。

进一步地，所述探针的5’端标记的荧光报告基团为FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为BHQ。

进一步地，还包括阳性质粒的标准品，所述阳性质粒的标准品是以尖孢镰刀菌的DNA为模版、经过如SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物PCR扩增回收，与pMD18-T质粒进行连接、转染后得到的。

本发明的目的之三采用以下技术方案实现：

一种用于检测尖孢镰刀菌的方法，包括以下步骤：

1)获得阳性质粒的标准品：以尖孢镰刀菌的DNA为模版、经过如SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物PCR扩增回收，与pMD18-T质粒进行连接、转染后得到阳性质粒的标准品；

2)PCR鉴定：分别以待测样品的DNA、阳性质粒的标准品为模板，以ddH₂O为阴性对照，通过如SEQ ID No.2所示的上游引物和SEQ ID No.3所示的下游引物进行PCR反应检验。