[发明专利]检测BRAF基因突变的检测体系及其试剂盒

说明书

本发明涉及一种检测BRAF基因突变的检测体系及其试剂盒，包括数字PCR预混液和引物探针混合液；引物探针混合液包括用于检测第600密码子V600E位点的上游引物、下游引物和肽核酸探针；上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，肽核酸探针的核苷酸序列与BRAF突变型基因第600密码子V600E位点完全互补且核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述肽核酸探针的5’端连接有由4个氨基酸构成的强螯合基团。本发明的检测BRAF基因突变的检测体系及其试剂盒灵敏度和特异性高，样品需求量少，可以快速便捷准确地进行PCR定量检测。

技术领域

本发明涉及一种检测BRAF基因突变的检测产品，属于生物技术领域。

背景技术

BRAF基因位于染色体7q34，是人类最重要的原癌基因之一，编码一种丝/苏氨酸激酶，是EGFR通路RAS/RAF/MEK/MRK/MAPK中重要的转导因子，参与调控细胞生长、分化和凋亡等多种生理过程。研究表明，在恶性黑色肿瘤、肺癌、结直肠癌等多种恶性肿瘤中存在不同比率的BRAF基因突变，其中约82％突变位于外显子15第1799核苷酸上，T突变为A(T1799A)，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代(V600E)，该突变使BRAF蛋白激活导致下游MEK-ERK信号通路持续激活，对肿瘤的生长增殖和侵袭转移至关重要。

BRAF基因突变多见于黑素瘤患者，中国黑色素瘤患者BRAF V600E突变率约为26％，白种人约为50％，BRAF V600E突变患者对于激酶抑制剂类药物治疗有效，对该类药物使用具有重要的指导意义。有研究证明，野生型KRAS肿瘤当中，发生BRAF V600E突变的个体，对EGFR抑制剂类药物疗效减弱或无效，而没发生BRAF突变的野生型个体，32％有反应，68％没反应。这提示今后重点检测BRAF的突变可为今后结肠癌临床用药给予指导，BRAF基因突变的患者接受EGFR-TKI药物治疗的有效率低，BRAF V600E突变可导致部分KRAS基因野生型患者对EGFR-TKI及EGFR单抗药物治疗不敏感。因此检测肿瘤患者BRAF基因突变情况可用于指导EGFR-TKI的靶向用药。同时，BRAF基因也可作为患者预后评价的独立性指标，BRAFV600E突变患者呈现预后更差的趋势。

外周血细胞游离DNA是来自正常细胞和肿瘤细胞死亡后释放的核酸片段总称。由于其再体内的半衰期较短且细胞释放的核酸会进入外周血，因此cfDNA较之于组织标本更能实时全面地反映患者体内的肿瘤情况。使用灵敏度较低的常规方法检测只能发现小部分患者在接受特定治疗前的肿瘤变异，采用高灵敏度法(如dPCR)检测则可以发现较高比例的携带突变型患者。数字PCR由于灵敏度等方面的优势，通过单分子扩增把低丰度的基因信号从复杂背景中分辨出来，可用于疾病或病毒的早期诊断或疗效监测。与常规的ARMs方法相比，数字PCR在检测血浆cfDNA时灵敏度明显优于ARMs法。

PNA(peptide nucleic acid)中文名称肽核酸，是一种全新的人工合成DNA类似物，它与DNA分子的差异在于戊糖磷酸二酯键骨架被中性肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代，其他结构与DNA一致。基于PNA的数字PCR技术主要依赖PNA探针的两个重要特性：第一，PNA只能与完全配对的互补DNA链杂交，只要有单一碱基发生错配，PNA就不能与互补的DNA链结合；第二，PNA寡聚体不能被DNA聚合酶识别，从而不会成为PCR扩增的引物。相反，它作为特定序列选择工具，可以阻止想应的PCR扩增。一旦模板中的目的基因发生突变并因此出现错配，DNA/PNA双链结合松动，DNA寡聚体模板链就可以正常延伸，作为PCR引物，使发生突变的样本在数字PCR中得到阳性扩增产物，而野生型基因则不会扩增。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种包含由强螯合基团修饰的肽核酸探针，灵敏度和特异性高模板DNA需求量少，可以快速便捷地进行精准定量PCR检测的BRAF基因突变检测检测体系及其试剂盒。