[发明专利]双荧光素酶报告基因表达载体pFireRluc的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及双荧光素酶报告基因表达载体pFireRluc的制备方法及其应用，可有效解决测试系统受到细胞活性以及两种不同的载体在转染过程中转染效率的影响问题，以pmirGLO载体为模板，以R1/R2为引物进行扩增获得Rluc序列片段，该序列两端加上SalI酶切位点，以Sal I单酶切pGL4.10载体，将Rluc序列片段插入pGL4.10载体中，构建重组的pFireRluc双荧光素酶报告基因载体，有效用于真核细胞表达鉴定和对双荧光素报告基因表达载体pFireRluc的活性检验中，实现双荧光素酶报告基因表达载体pFireRluc在真核细胞表达鉴定中和活性试验中的应用。本发明方法新颖独特，提高实验数据的可信度，减小细胞活性和转染效率对实验结果的影响，能够排除细胞活性和转染效率对实验结果的影响，提高检测结果的稳定性和可靠性。

技术领域

本发明涉及分子生物，特别是一种双荧光素酶报告基因表达载体pFireRluc的制备方法及其应用。

背景技术

Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。通过荧光素酶测定仪(luminometer)luciferin氧化过程中释放的生物荧光，可以灵敏、高效地检测基因的表达。该检测系统是检测转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用的一种检测方法。双荧光素酶报告基因测试系统将萤火虫和海肾荧光素酶共表达，用萤火虫荧光素酶定量目的基因的表达，采用第二个报告基因（海肾荧光素酶）来减少实验的变化因素。传统的共报告基因包括CAT，β-Gal，GUS不够便利，因为各自的测试化学，处理要求检测特点存在差异。pGL4.10为Promega公司构建的荧光素酶报告基因载体，含有萤火虫荧光素酶报告基因（Firefly），可用作定量分析哺乳动物基因表达的工具。但由于pGL系列载体中只含有萤火虫荧光素酶报告基因，使用中无法排除本底因素的干扰，容易产生检测误差。此外，Promega公司也在此基础上发展了双报告基因技术，将萤火虫荧光素酶测试和海肾荧光素酶测试相结合，引入pRL载体系统来表达第二个报告基因海肾荧光素酶，共转染分别含有萤火虫和海肾荧光素酶报告基因的载体质粒于真核细胞中，可以在单管中进行双荧光素酶报告基因测试。但该测试系统会受到细胞活性以及两种不同的载体在转染过程中转染效率的影响。因此，研制新的双荧光素酶报告基因表达载体势在必行。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种双荧光素酶报告基因表达载体pFireRluc的制备方法及其应用，可有效解决测试系统受到细胞活性以及两种不同的载体在转染过程中转染效率的影响问题。

本发明解决的技术方案是，一种双荧光素酶报告基因表达载体pFireRluc的制备方法及其应用，其制备方法是，以pmirGLO载体为模板，以R1/R2为引物进行扩增获得Rluc序列片段，该序列两端加上SalI酶切位点，以Sal I单酶切pGL4.10载体，将Rluc序列片段插入pGL4.10载体中，构建重组的pFireRluc双荧光素酶报告基因载体；具体方法包括以下步骤：

（1）、设计Rluc引物：

根据pmirGLO质粒中的Rluc表达单元DNA序列设计引物R1、R2：

（2）、PCR扩增：

以pmirGLO载体为模板，以R1、R2为引物进行PCR扩增，获得Rluc表达单元；

（3）、产物电泳：

将PCR扩增产物与10×溴酚蓝加样缓冲液混合，进行琼脂糖凝胶电泳，用DNAMakrer2000判断扩增片段大小，用凝胶分析系统照相；