[发明专利]一种四环素诱导启动子及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种四环素诱导启动子，其特征在于，所述启动子为将组成型启动子的间隔序列突变为四环素操纵基因；

其中，所述间隔序列包括-35区至-10区之间的核酸序列、-10区至转录起始位点之间的核酸序列或-(55±3) bp至-35区之间的核酸序列中的任意一种或至少两种的组合；

所述四环素操纵基因的核酸序列如SEQ ID NO.2-3所示；

所述启动子还包括tac启动子、四环素阻遏蛋白基因和rrnBT1终止子。

2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述组成型启动子包括谷氨酸过氧化物酶启动子；

所述谷氨酸过氧化物酶启动子的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求1或2所述的四环素诱导启动子。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包括目的基因。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求3或4所述的表达载体。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括硫氧化菌。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述硫氧化菌包括嗜盐嗜碱硫碱弧菌。

8.一种目的蛋白的表达方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）构建如权利要求3或4所述的表达载体；

（2）将步骤（1）所述表达载体转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；

（3）采用接合转移的方式，将筛选的表达载体转入宿主细胞，进行目的蛋白的表达。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述构建的方法包括以下步骤：

（1’）构建包括组成型启动子的克隆载体；

（2’）利用四环素操纵基因突变步骤（1’）所述组成型启动子的间隔序列；

（3’）将tac启动子、四环素阻遏蛋白和rrnBT1终止子连接入克隆载体，得到包括四环素诱导启动子的克隆载体；

（4’）PCR扩增步骤（3’）所述克隆载体的四环素诱导启动子片段，连接入带有目的基因的表达载体，得到所述包括四环素诱导启动子的表达载体。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤（1’）所述组成型启动子包括谷氨酸过氧化物酶启动子。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤（2’）所述间隔序列包括-35区至-10区之间的核酸序列、-10区至转录起始位点之间的核酸序列或-(55±3) bp至-35区之前的核酸序列中的任意一种或至少两种的组合。

12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述构建的方法采用的引物如SEQ ID NO.4-16所示。

13.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述感受态细胞包括大肠杆菌。