[发明专利]用于检测β2-微球蛋白的试剂的制备方法

说明书

本发明涉及一种制备用于检测β2‑微球蛋白的试剂的方法，包括1)使用缓冲液稀释第一微球和第一抗体，得到所述第一微球与第一抗体的混合溶液，加入交联剂进行孵育，加入封闭剂封闭，得到经标记的第一微球；2)使用缓冲液稀释第二微球和第二抗体，得到所述第二微球与第二抗体的混合溶液，加入交联剂进行孵育，加入封闭剂封闭，得到经标记的第二微球；3)将所述经标记的第一微球与经标记的第二微球混合；其中，所述第一微球和第二微球为直径不同的羧基微球；所述第一抗体与第二抗体不同；所述缓冲液的pH为6.3～9.5。本发明还涉及由该方法制备得到的试剂及含有该试剂的试剂盒。

技术领域

本发明属于免疫检测领域，具体涉及一种制备用于检测β2-微球蛋白的试剂的方法。

背景技术

β2-微球蛋白主要是用于肾功能评价及用作非特异性肿瘤标志物，尿液浓度增高血清水平正常则是由于肾小管重吸收减少，见于肾小管疾病如Fanconi综合症、Lowe综合症、慢性铬中毒、急性肾小管坏死、胱氨酸鸟症、肾移植、急性或慢性肾盂肾炎，而膀胱炎正常；血清水平增高尿液浓度正常则由于肾小球病过滤率降低，见于急性或慢性肾炎；血清水平和尿液水平浓度均升高则见于生成增多并超过肾小管重吸收能力，见于恶性肿瘤如肝细胞癌、肺癌、胃及结肠癌、多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤、慢性淋巴白血病。

β2-微球蛋白的测定一般采用RIA法、ELISA法与CLlA法、免疫比浊法等，但在临床上使用胶乳作为载体微球的免疫学方法制备的诊断试剂，能够利用自动分析仪器，因此近年来在临床检查等中被广泛使用。

目前，微球与待标记物连接方法主要有物理吸附和化学偶联。其中，化学偶联是利用活化交联剂将待标记物和微球通过化学反应连接在一起，连接后的稳定性较物理吸附更好(JL Ortega-Vinuesa et al.,Journal of Colloid&Interface Science,1995)。用于化学偶联的微球表面会修饰有一些化学基团，如羧基、氨基和羟基(对应于羧基微球、氨基微球和羟基微球)等。而在这些之中，羧基微球应用更为广泛。

利用活化剂制备羧基微球的方法是众所周知的，比如CN106353507A公开了一种将抗体偶联至微球的方法，该方法在用缓冲液重悬微粒后加入EDC和sulfo-NHS活化反应15分钟，反应后离心清洗并超声重悬；随后将溶解的抗体与微粒混合再进行偶联反应，偶联后需再次进行离心清洗及重悬。又如CN105606822A公开了一种使用抗体致敏聚苯乙烯胶乳颗粒的方法，具体用pH5.0的MES洗涤胶乳三次并超声分散，加入EDAC活化15分钟，洗涤2次并超声分散，然后依次加入抗体混合，封闭得到致敏颗粒。

然而，上述方法在制备过程中不仅需要进行离心以去除游离的活化剂和游离未结合的抗体，还需要对微球进行超声重悬以使其分散。这些步骤虽然去除了多余组分并解决了羧基微球制备时易凝集的问题，但使得操作过程变得效率低且耗时，不利于工业化制备。

针对这种情况，已提出了不需纯化的方法，例如在CN107167586A公开了这样的方法：先将胶乳加到缓冲液，在加入EDC进行活化15分钟，之后调节pH至7.60，再加入SLO进行交联反应2h，最后加入两种封闭剂封闭得到成品的方法，该方法不需要进行离心或超滤步骤，从而提高制备效率。

但是，这一方法仍需要先用交联剂活化微球一段时间，之后还需要额外调节pH值后才能进行交联反应，这不可避免地延长制备时间、增加了操作的复杂度从而不便于在工业中应用。

因此，在β2-微球蛋白检测时，仍然存在对操作更简单、耗时更短的羧基微球标记方法的需求。

发明内容

为此，本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单的用于检测β2-微球蛋白的羧基微球标记方法。另一方面进一步解决如何在标记过程中防止微球凝集的问题。又一方面还解决了如何提高标记效率的问题。再一方面还解决了提高标记后试剂的稳定性的问题。