[发明专利]一种单细胞测序检测活化T细胞的方法

说明书

本发明公开了一种利用单细胞测序检测活化T细胞的方法，包括以下步骤：（1）获取经异源基因杂交细胞诱导扩增的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte,CTL）；（2）分离单细胞并进行裂解；（3）对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA；（4）以cDNA为模板进行PCR扩增，产物纯化，进行Tagmentation反应，完成cDNA测序文库构建；（5）对构建的cDNA文库进行高通量测序；（6）测序结果进行生物信息学分析，检测T细胞活化程度。

技术领域

本发明属于生物医学领域，尤其是涉及一种单细胞测序检测活化T细胞的方法。

背景技术

T细胞是淋巴细胞的一种，在免疫反应中扮演着重要的角色。T细胞在胸腺内分化成熟，成熟后移居于周围淋巴组织中。T细胞主要用以抵抗外来入侵物且具有多样的生物学功能。

T细胞治疗是细胞免疫治疗的核心手段，被认为最具前景、最有希望消灭肿瘤的方法。然而，目前使用的T细胞存在活性不强、数量不足、不能向肿瘤部位聚集、无有效的疗效监测手段等难题。因此，围绕这些关键科学技术问题，我们前期通过解除T细胞抑制因子PD-1，构建活性T细胞；以异源基因杂交细胞扩增T细胞并赋予其抗癌特性，从而获得数量更多、活性更强的CTLs，发挥更理想的高效抗癌效应。然而，利用传统的方法（流式细胞仪检测细胞表面活化分子、细胞杀伤试验、ELISA检测细胞活化后分泌的细胞因子等）在体外对所诱生的CTLs的活化程度进行检测，存在检测结果受时间和空间影响较大的问题。

同一细胞在不同的生长时期及生长环境下，其基因表达情况是不完全相同的，单细胞测序技术可以在单细胞水平对全转录组进行扩增与测序，在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控的规律。因此，利用单细胞测序技术及生物信息学分析技术，对T细胞进行分析，可以更好地研究其单个细胞内整体水平的基因表达状态和基因结构信息，了解其基因转录情况、转录调控规律并进行验证，为能更早期、更准确的了解T细胞活化状态提供新途径、新方法。

发明内容

本发明的目的在于针对上述存在的科学问题，提供一种单细胞测序检测活化T细胞的方法。

本发明的技术方案概述如下：

本发明的单细胞测序检测活化T细胞的方法，包括以下步骤：

1）获取经异源基因杂交细胞诱导扩增的肿瘤特异性CTLs；

2）分离单细胞并进行裂解：分离单细胞，加入裂解缓冲液中进行裂解；

3）对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA：使用美国ThermoFisher公司的SuperScript试剂盒构建逆转录体系，对上述步骤2）获得的细胞裂解液进行逆转录，得到cDNA；

4）以cDNA为模板进行PCR扩增，构建测序文库，进行测序：使用美国Illumina公司的NexteraXT试剂盒，按照说明书对上述步骤3）得到的逆转录产物进行扩增和纯化，构建高通量测序文库；完成后将文库送交测序；

5）对测序结果进行生物信息学分析，检测T细胞的活化程度。

优选的，以上所述步骤1）中，将体外诱导扩增的肿瘤特异性CTLs进行单细胞测序，从mRNA水平上检测单细胞活化程度。

本发明突出的实质性特点和显著的进步是：

通过利用单细胞测序技术早期、准确的了解T细胞的活化情况，将体外诱导扩增的肿瘤特异性CTLs进行单细胞测序，从mRNA水平上检测单细胞活化程度，较传统方法如流式细胞仪检测细胞表面活化分子、细胞杀伤试验、ELISA检测细胞活化后分泌的细胞因子等，更为早期、快速、准确。

附图说明

图1为逆转录及构建测序文库的示意图。