[发明专利]蛋白-细胞偶联物、其制备方法和用途

权利要求书

1.蛋白-细胞偶联物，其为蛋白和细胞分别与连接接头共价连接形成的偶联物，所述细胞在未偶联时，其表面分布着游离的巯基；所述的连接接头来源于双功能交联剂，所述双功能交联剂同时含有能与氨基发生反应的基团和与巯基发生反应的基团；其中所述细胞选自淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞中的至少一种，并且其中所述的蛋白是雪蓝蛋白或胰岛素，其中所述的双功能交联剂同时含有琥珀酰亚氨基和马来酰亚氨基基团，其中所述双功能交联剂的琥珀酰亚氨基与蛋白上的游离氨基反应形成酰胺键，所述双功能交联剂的马来酰亚氨基与细胞上的游离巯基反应形成硫醚键，其中所述的双功能交联剂是琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧化物(SMCC)。

2.一种权利要求1有效诱导免疫应答的蛋白-细胞偶联物的制备方法，其包括以下步骤：

(1)将蛋白与双功能交联剂接触，以使双功能交联剂的连接基团与蛋白发生共价连接，得到第一混合物，该混合物包含结合了连接基团的蛋白；

(2)任选地，还包括去除第一混合物中未连接的双功能交联剂的步骤，以得到纯化的结合了连接基团的蛋白；

(3)将步骤(1)或(2)获得的结合了连接基团的蛋白与细胞接触，以使所述连接基团与细胞发生共价连接，得到第二混合物，该混合物包含了分别与连接接头共价连接的蛋白和细胞偶联物，即蛋白-细胞偶联物；

(4)任选地，还包括去除第二混合物中未与细胞连接的蛋白的步骤，以得到纯化的包含有蛋白-细胞偶联物的第二混合物；

或者，所述制备方法包括以下步骤：

(a)将细胞与双功能交联剂接触，以使双功能交联剂的连接基团与细胞发生共价连接，得到第一混合物，该混合物包含结合了连接基团的细胞；

(b)任选地，还包括去除第一混合物中未连接的双功能交联剂的步骤，以得到纯化的结合了连接基团的细胞；

(c)将步骤(a)或(b)获得的结合了连接基团的细胞与蛋白接触，以使所述连接基团与蛋白发生共价连接，得到第二混合物，该混合物包含了分别与连接接头共价连接的蛋白和细胞偶联物，即蛋白-细胞偶联物；

(d)任选地，还包括去除第二混合物中未与细胞连接的蛋白的步骤，以得到纯化的包含有蛋白-细胞偶联物的第二混合物；

其中所述细胞在未偶联时，其表面分布着游离的巯基；

并且所述的双功能交联剂同时含有能与氨基发生反应的基团和与巯基发生反应的基团；

其中所述细胞选自淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞中的至少一种，并且其中所述的蛋白是雪蓝蛋白或胰岛素，其中所述的双功能交联剂同时含有琥珀酰亚氨基和马来酰亚氨基基团，其中所述双功能交联剂的琥珀酰亚氨基与蛋白上的游离氨基反应形成酰胺键，所述双功能交联剂的马来酰亚氨基与细胞上的游离巯基反应形成硫醚键，其中所述的双功能交联剂是琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧化物(SMCC)。

3.权利要求2的制备方法，其特征在于以下(1)～(4)项中的一项或多项：

(1)所述接触时的温度为4～40℃；

(2)所述接触的时间为10～60min；

(3)所述接触发生在溶液中，所述溶液为生理盐水或缓冲溶液，所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液；

(4)所述接触时的pH值为4.0～9.0。

4.权利要求2的制备方法，其中所述接触时的温度为6～37℃。

5.权利要求2的制备方法，其中所述接触时的温度为15～25℃。

6.权利要求2的制备方法，其中所述接触时的温度为室温。

7.权利要求2的制备方法，其中所述接触的时间为20～50min。

8.权利要求2的制备方法，其中所述接触的时间为30～40min。