[发明专利]一种增大通透性的全细胞催化剂及其制备方法和应用

说明书

一种增大通透性的全细胞催化剂及其制备方法和应用。利用磷酸缓冲液重悬发酵培养的表达鼠李糖苷酶的大肠杆菌菌体，得到全细胞催化剂，再加入离子液体或低共熔溶剂置于水浴摇床进行反应；离子液体或低共熔溶剂占总体积的1%~20%，反应温度30~60℃，转速180 rpm；处理时间0.5~3 h；处理后离心并收集菌体，利用磷酸缓冲液清洗掉残留离子液体/低共熔溶剂，既得通透性增大的全细胞催化剂。本发明采用离子液体/低共熔溶剂改善全细胞催化剂的通透性，提高胞内酶与底物接触几率。

技术领域

本发明属于生物催化技术领域，具体涉及一种增大通透性的全细胞催化剂及其制备方法和应用。

背景技术

全细胞催化避免了纯酶的分离和纯化过程，从而可降低生产成本，并且细胞与产物容易分离从而实现酶的回收和再利用(Renewable Energy,2016,85:1002-1010)。另外，被全细胞保护的胞内酶比游离酶更稳定(Algal Research,2017,28:16-23)。然而，由于全细胞催化剂中存在细胞壁/膜，底物与酶的活性位点的结合受到限制，产品难以及时流出细胞外，导致产物抑制和目标产物的收率降低。因此，有必要采取措施增加酶与底物之间的接触，从而提高全细胞催化的效率。目前，应用最广泛的方法有以下两种：1)利用细胞表面展示技术将目的蛋白基因锚定在细胞表面，酶与底物可以直接在细胞表面结合(AppliedBiochemistry and Biotechnology,2017,1:1-23)，进行催化过程；2)通过物理、化学以及分子生物学方法提高细胞渗透性来增加细胞内外的传质效率以增强酶与底物的接触(Journal of Biotechnology,2017,248:9-14)。尽管第一种方法可以在一定程度上增加酶与底物的接触，但需要考虑被展示目的蛋白的分子大小以及目标蛋白的筛选和其他复杂的分子生物学过程。因此更多学者倾向于第二种方法。提高细胞通透性，允许小分子和某些大分子自由地通过细胞而不破坏细胞生物体并且可以避免复杂的操作过程。

离子液体和低共熔溶剂是近年来受到广泛关注催化过程的促进剂。离子液体具有环境友好，具有低饱和蒸气压，不易燃性，疏水性和良好的热力学稳定性(CarbohydratePolymers,2015,118:150-155)等特性。有研究以离子液体[EMIM][BF4]作为溶剂，通过脂肪酶合成吲哚四氢色烯，并且获得了较高的得率(77-98％)(Catalysts,2017,7:185-195)，自低共熔溶剂被发现以来，已被用于分离过程、功能材料、化学反应、电化学等领域。由于其低成本，低毒性和可生物降解的特性而表现出良好的应用前景，离子液体与低共熔溶剂具有非常相似的物理化学性质，使其成为原子利用率接近100％的绿色溶剂。

发明内容

解决的技术问题：本发明针对全细胞催化剂细胞内外传质及其改善方法的相关问题，以重组大肠杆菌细胞为研究对象，一种增大通透性的全细胞催化剂及其制备方法和应用，能够增大细胞通透性，增强细胞内外传质，利用胞内糖苷酶催化芦丁合成珍稀天然产物的方法。

技术方案：一种增大通透性的全细胞催化剂的制备方法，步骤为：利用磷酸缓冲液重悬发酵培养的表达鼠李糖苷酶的大肠杆菌菌体，得到全细胞催化剂，再加入离子液体或低共熔溶剂置于水浴摇床进行反应；离子液体或低共熔溶剂占总体积的1％～20％，反应温度30～60℃，转速180rpm；处理时间0.5～3h；处理后离心并收集菌体，利用磷酸缓冲液清洗掉残留离子液体/低共熔溶剂，既得通透性增大的全细胞催化剂。

上述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐、1-乙基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐；上述低共熔溶剂为质量比1:2的氯化胆碱-尿素、质量比1:2的氯化胆碱-甘油、质量比1:2的氯化胆碱-乙酰胺、质量比1:2的氯化胆碱-乙二醇、质量比1:1的氯化胆碱-丙二酸。

上述大肠杆菌为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。

上述制备方法制得的全细胞催化剂。