[发明专利]一种电泳用分离胶及其分离多肽的方法

说明书

本发明公开了一种电泳用分离胶及其分离多肽的方法。制备凝胶配方中用乙二醇代替甘油，不使用尿素，小于5kd条带不会弯曲。该操作方便简单，避免了尿素加入时反应体积增大，能够很好分离条带较多的小肽样品。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种电泳用分离胶及其分离多肽的方法。

背景技术

多肽类化合物广泛存在于自然界中，其中对具有一定生物学活性的多肽的研究，一直是药物开发的一个主要方向。生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的，生命活动中的细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节等均与活性多肽密切相关。随着现代科技的飞速发展，从天然产物中获得肽类物质的手段也不断得到提高。一些新方法、新思路的应用，不断有新的肽类物质被发现应用于防病治病之中。

采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化，同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段，如层析、电泳等。

电泳的经典方法(Schagger 1987)制胶步骤中使用的是甘油和尿素，导致小于5kd的蛋白电泳后弯曲。

发明内容

为了解决小于5kd的蛋白电泳后弯曲的问题，本发明提出了一种电泳用分离胶及电泳分离多肽的方法。

一种电泳用分离胶，其特征在于，包括如下组分：PAA，凝胶缓冲液，乙二醇，过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)。

优选的电泳用分离胶，由如下组分配置而成：40％PAA(19:1)2.7ml，凝胶缓冲液1.5ml，电泳级乙二醇1.8ml，10％过硫酸铵45μl，四甲基乙二胺9μl。

一种电泳分离多肽的方法，按照下述步骤进行：

(1)配制分离胶

将40％PAA、凝胶缓冲液和乙二醇加入到小烧杯中混合；加入10％过硫酸铵和四甲基乙二胺，混匀5-10秒，以使溶液充分混匀，制成分离胶溶液；在凝胶模具中迅速灌入分离胶溶液，然后在分离胶溶液上覆盖一层1-3cm的水层，使凝胶表面保持平整；静置30-60分钟，待分离胶和水层之间出现一个清晰的界面表示凝胶已聚合；去除覆盖在分离胶上的水层，用滤纸将残留的水吸去；

(2)配制浓缩胶

将双蒸水、40％PAA和凝胶缓冲液加入到小烧杯中混合；加入10％过硫酸铵和四甲基乙二胺，混匀5-10秒，以使溶液充分混匀，制成凝胶；将梳子插入凝胶内，避免产生气泡；静置30-60分钟，待凝胶聚合后配制成浓缩胶；

(3)电泳

取一管分装好的Marker样品，95℃处理5分钟，充分混匀后备用；电泳前，将10×阳极缓冲液和10×阴极缓冲液用蒸馏水稀释成1×缓冲液备用；将电泳槽的外槽加入1×阳极缓冲液，内槽加入1×阴极缓冲液，轻柔拔出梳子，将Marker或经过2×Tricine蛋白样品上样缓冲液处理后的蛋白样品加入点样孔，80-120V电泳30-60分钟左右，待指示前沿到达分离胶上沿时，把电压调至150-200V，至蓝色指示前沿至分离胶3/4位置时即可停止电泳，整个电泳过程需要2-3小时；

(4)染色及脱色

卸下电泳胶板，撬开玻璃板，将凝胶整块刮到装有染色液的平皿中，置于摇床上45r/min条件下染色1h；从染色液中取出凝胶，用蒸馏水清洗3-5次，转移到装有脱色液的平皿中，置于摇床上45r/min条件下脱色；脱色后，将凝胶拍照保存或将凝胶浸于水中保存。

所述的分离胶、浓缩胶均为0.75mm厚度的凝胶。