[发明专利]用于透明化液滴成像的光片荧光显微成像装置及检测方法

说明书

本发明公开了一种用于透明化液滴成像的光片荧光显微成像装置及检测方法，成像装置包括光源整形模块、光片生成模块、样品控制模块和图像采集模块；光源整形模块用于将圆形光整形为椭圆形光斑；光片生成模块用于根据椭圆形光斑生成片状光束；样品控制模块用于当片状光束照射在样品上时控制样品沿着与光轴垂直的方向运动；图像采集模块用于采集样品在运动时不同位置被激发出的荧光信号从而获得样品的三维图像序列。本发明能够在短光程下产生椭圆光，从而生成一种高而厚的光片，使光束形状更适于深层液滴原位封闭成像，同时由于无需用狭缝阻拦激光，激光能量利用率提高四倍以上，能在大视野下提升通光孔径，减小采集端的长度，体积小巧，集成度更高。

技术领域

本发明属于生物检测领域，更具体地，涉及一种用于透明化液滴成像的光片荧光显微成像装置及检测方法。

背景技术

乳液液滴是化学生物领域中实用并且正在迅速发展的有力工具之一。乳液液滴的尺寸通常在数微米到几百微米之间，在特定表面活性剂的作用下稳定存在于油包水乳液中。由于当前手段限制和技术惯例等原因，科研以及生产中的乳液液滴一般处于10微米到300微米之间。微乳液滴由于能够将样品(多为水溶液)均匀的分散为多份体积近乎相同的单元；这些单元相互隔绝，形成了独立的反应空间，从而可以极大的提高反应的通量。由于形成微乳液滴大小相同或相近，可以用于合成大量微小尺度的结晶颗粒、聚合物小球等；形成的固态颗粒物大小相近，并且合成过程容易调控。

微乳液滴独立分隔的特性可以让数字链式酶反应等基于极限稀释策略的检测定量方法极大程度的提高精确度和分辨率。目前常见的数字细菌计数、数字细胞计数，数字聚合酶链式反应等数字式定量技术都是基于微乳液滴的均匀分隔特点，其策略分为三步：样品液滴化分隔、信号放大反应以及计数处理。其中荧光液滴的计数处理常有两种办法：液滴逐个通过微流通道并在荧光探测点的时序性计数，以及液滴平铺在一个平面或者旋转圆柱表面上，通过荧光成像的办法获取荧光液滴的位置和数目等信息。以上两种，逐个探测计数以及平面拍照方法都存在不足。逐个探测计数中的液滴处于流动状态，需要稳定乳液的流速，因此需要额外微流体控制，对于黏度高或者液滴致密的乳液，还需要在乳液进入探测点前加入稀释油以间隔液滴。平面拍照的方法只能拍到至多三层液滴，由于折射的原因，如果不做特别折射率处理，更加深层的液滴的成像几乎无法实现。除此之外，两种计数方法都需要在特定的容器内成像，此中必将涉及扩增后产物的转移。这一做法将极有可能污染后续的实验，使得后续实验出现假阳性的概率大大增加。

为避免产物的转移带来的污染，在离心管内原位封闭读取微流孔板芯片的方法已经问世。然而此方法存在以下缺点：第一，涉及微流芯片加工工艺，成本不菲，且需要与芯片相匹配的反应设备(例如聚合酶链式反应所需的加热设备)以及减小蒸发设备；第二，在微流芯片上生产微乳液所需的气路、流路管道复杂，且微流芯片上得到的液滴数量、生成液滴的速度远小于微乳液滴的分隔方法，数字检测的动态范围和灵敏度因此掣肘。要实现原位封闭大量微乳液滴的光学信号读取，需要解决如何进行深层液滴成像的问题。

光片荧光显微技术是利用片状光源层析照明的办法，通过逐层扫描激发样品的荧光信号，得到序列荧光图像，然后将多帧图像进行三维重构。相比于普通的宽场照明，光片扫描通过选择性激发某一个平面，可以有效地避免焦外激发，从而很大程度上提高成像的对比度和分辨率，并具备三维成像能力。目前，光片显微技术通常采用扩束镜和可调狭缝光阑，产生高而薄或矮而厚的光片，高而薄的光片分辨率高但聚焦范围(可以理解为可用范围)窄，矮而厚的光片可用范围大但光片很矮。因此此类光片适用于小型生物体或组织成像，如斑马鱼胚胎，果蝇、鼠脑等，不适用于大量液滴这样一种大样品的深层原位封闭成像。此外，现有的光片显微镜系统体积较为庞大，价格高昂，操作繁琐，且部分激光被狭缝光阑阻拦，能量利用率降低。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种用于透明化液滴成像的光片荧光显微成像装置及检测方法，旨在解决现有技术中大量微乳液滴检测通量低的问题。