[发明专利]一种用于免疫印迹分析的生物发光探针及其应用

说明书

本发明提供了一种用于免疫印迹分析的生物发光探针，所述探针的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括：可结合一级抗体的串联Z结构域；具有生物发光功能的萤光素酶结构域；上述两个结构域的连接区。本发明同时还提供了上述探针的制备方法以及应用。该探针可通过大肠杆菌表达获得，无需通过动物活体或哺乳动物细胞制备，因此具有生产成本低廉的特点；此外，该探针可识别不同来源的一级抗体，并针对待检测的目的蛋白质产生高灵敏度的生物发光信号，因此可替代二级抗体用于免疫印迹分析。

技术领域

本发明涉及一种用于免疫印迹分析的新型生物发光探针，属于免疫分析领域。

背景技术

基于抗原-抗体特异性识别的蛋白质免疫印迹分析不仅是生物化学与分子生物学研究中的必要工具，同时也在疾病诊断、食品安全和法医鉴定中具有重要的应用价值。免疫印迹技术的关键在于将抗体对蛋白质的识别转化为可检测的信号。上述信号转化的方式可分为直接法和间接法两类。其中，直接法是在能够识别目的蛋白质的一级抗体上标记信号分子，从而实现目的蛋白质的直接检测。而间接法则先使用未标记的一级抗体对目的蛋白进行识别，然后再通过标记了信号分子的二级抗体对一级抗体进行识别，从而实现目的蛋白质的检测。相对于直接法，间接法具有灵敏度高的优点，因此已经成为了免疫印迹分析中应用最为广泛的方法。

然而，利用二级抗体进行免疫印迹分析仍存在诸多不足，主要包括：1)通过化学方法对抗体进行标记不仅复杂、繁琐，而且有时会导致抗体的稳定性和亲和力下降；2)二级抗体的生产大多依赖于动物活体或哺乳动物细胞，导致生产成本相对高昂；3)二级抗体的来源必须与一级抗体不同，因此通用性较差。

发明内容

为克服现有技术中的不足，本发明提供了一种用于免疫印迹分析的新型生物发光探针，该探针可通过大肠杆菌表达获得，无需通过动物活体或哺乳动物细胞制备，因此具有生产成本低廉的特点；此外，该探针可识别不同来源的一级抗体，并针对待检测的目的蛋白质产生高灵敏度的生物发光信号，因此可替代二级抗体用于免疫印迹分析。

实现本发明上述目的所采用的技术方案为：

一种用于免疫印迹分析的生物发光探针，所述探针的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，包括：可结合一级抗体的串联Z结构域；具有生物发光功能的萤光素酶结构域；上述两个结构域的连接区。

一种编码权利要求1所述氨基酸序列的基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，包括：串联Z结构域的编码序列；萤光素酶结构域的编码序列；上述两个结构域连接区的编码序列。

本发明提供了上述用于免疫印迹分析的生物发光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)编码基因片段的设计与制备：对Z结构域和萤光素酶结构域的编码序列和连接区编码序列进行拼接，然后根据大肠杆菌密码子偏好性，对拼接序列进行序列优化，从而使其在大肠杆菌中具有更高的表达效率，优化后的基因片段通过全基因合成制备得到，并连入pUC57载体。

(2)编码基因片段的扩增和纯化：以上述pUC57载体为模板，通过特异性引物P1和P2扩增所述探针的编码基因片段，并在其两端添加NdeI和SalI酶切位点，所得扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳回收，即制得编码基因片段；所述特异性引物P1和P2的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

(3)酶切、连接及转化：第(2)步所得编码基因片段和pET-26b(+)载体分别通过限制性核酸内切酶NdeI和SalI进行双酶切，将酶切后的基因片段和质粒载体混合后，通过T4DNA连接酶进行连接，所得连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，并挑取转化子进行测序，测序结果正确的表达载体保存、待用；