[发明专利]一种干扰素重组融合蛋白及其应用

说明书

本发明公开了一种干扰素重组融合蛋白及其应用，所述融合蛋白由犬干扰素α和蓖麻毒素B链经(G₄S)₃柔性linker连接而形成。所述犬干扰素融合蛋白比普通犬干扰素α抗病毒活性提高，具有广谱抗病毒作用并提高了犬自身的免疫应答。

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及由犬干扰素α与蓖麻毒素B链蛋白组成的融合蛋白及其制备方法。

背景技术

干扰素(Interferon，IFN)是一种具有强大抗病毒活性的糖蛋白，是宿主防御病原体侵入的第一批防线之一。干扰素在病毒感染过程中参与许多免疫相互作用，并促成诱导和调节先天和适应性抗病毒机制。然而，病毒可以“干扰”干扰素的抗病毒功能而逃逸免疫清除、造成慢性病毒感染。而基因工程重组干扰素的发展，使干扰素作为一种抗病毒药物选择依然具有很大吸引力，但目前用于治疗犬病毒病的重组犬干扰素因为半衰期短、频繁给药、中和抗体产生以及种属差异等原因而使治疗效果大打折扣。

蓖麻毒素(Ricin toxin，RT)由RTA、RTB两个肽链以二硫键共价相连接。RTB链由260个氨基酸组成，分子量约34000，是能与半乳糖/N-乙酰基半乳糖胺特定结构结合的外源凝集素蛋白，具有凝集素活性。RTB单独存在时并没有毒性，目前认为RTB主要由二个功能：第一，它可以帮助RTA转运到细胞溶质中，抑制蛋白质的合成。第二，RTB配体具有广泛与受体特异性结合的能力，可以结合不同的糖结构，调解各种生物过程，包括细胞与宿主、病原体相互作用和先天免疫反应，可以用作异源性疫苗抗原的载体，例如RTB可融合不同的轮状病毒抗原VP7，P24及NSP4等，发挥粘膜佐剂作用，增强机体免疫反应。

发明内容

本发明提供一种具有高效抗病毒活性的融合蛋白。该蛋白由犬干扰素α与蓖麻毒素B链组成的融合蛋白。

本发明将犬干扰素α(CaIFNα)与蓖麻毒素B链(RTB)通过大肠杆菌原核表达系统进行共表达，制备具有干扰素生物活性的重组CaIFNα/RTB融合蛋白。

本发明的技术方案是：

本发明还提供了包含有SEQ ID 2氨基酸序列的融合蛋白CaIFNα-linker-RTB(CaIFNα/RTB)，该融合蛋白包括三部分，CaIFNα与RTB通过linker相连接，所述CaIFNα的蛋白序列为SEQ ID 3，所述RTB的蛋白序列为SEQ ID 4。

所述linker由(GGGGS)_n组成，所述n＝1～5。优选n＝3

优选所述linker为GGGGSGGGGSGGGGS。

所述融合蛋白还包括有纯化标签，优选纯化标签为His标签。

本发明还提供了编码上述融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID 1。

所述SEQ ID 1为融合蛋白核苷酸序列进行优化之后的结果，通常密码子适应指数CAI＝1.0是被认为该基因在该表达系统中为最优的高效表达状态，CAI值越低表明在宿主中表达水平越低。基因中GC含量最理想分布范围为30～70％，在任何区域内超过该范围均会影响翻译和转录效率。利用软件检测发现犬干扰素α原始基因的密码子在大肠杆菌中CAI值为0.27GC百分比为59.7％；而通过密码子优化后CAI值为1.通过基因优化显著降低了低密码子的使用率，避免了稀有密码子对蛋白表达的影响，改善了基因的GC含量，提高了转录翻译效率。

本发明还公开一种包含SEQ ID 1核酸序列的重组载体。

所述重组载体选自PET系列载体、pUC系列载体、pCold系列载体、pSUMO系列载体、pDsRed系列载体、pBAD系列载体、pMAL系列载体、pACYC系列载体、pQE系列载体、pGEX系列载体。优选pUC57或pET-28。

本发明还公开一种包含上述重组载体的工程菌。