[发明专利]一个烟草氯离子通道蛋白NtCLC2及其应用

说明书

本发明属于烟草基因工程技术领域，具体涉及一个烟草氯离子通道蛋白NtCLC2及其应用专利申请。该基因CDS序列包括2343bp碱基，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示；其中第1426位‑1738位核苷酸为特异性核酸片段。烟草氯离子通道蛋白NtCLC2是烟草氯离子代谢的关键蛋白，通过病毒诱导的基因沉默（VIGS）的技术，抑制NtCLC2基因表达后，转基因沉默植株中氯离子含量明显降低。基于此，可为培育低氯含量烟草新品种奠定良好基础，同时也为烟叶质量的稳定和卷烟质量改善提供了根本性的技术支撑。

技术领域

本发明属于烟草基因工程技术领域，具体涉及一个烟草氯离子通道蛋白NtCLC2及其应用专利申请。

背景技术

针对烟草的已有研究普遍认为，烟叶中的氯离子含量以0.3~0.8为宜，在含量达到1%时会影响阴燃持火性，进一步高于1%时会出现黑灰熄火现象；另一方面，烟叶中氯离子含量过高时会造成淀粉积累多，叶片肥厚而脆，吸湿性大，使得存放时颜色易变深，产生不良气味。总之，烟叶中氯离子含量对于烟叶质量具有较为重要的直接影响。

基于烟叶中氯离子含量对烟草品质的直接影响和其重要性，部分研究人员对全国各地烟叶中氯离子含量进行了检测统计，结果表明（中国烟草总公司郑州烟草研究院，《中国烟叶质量白皮书（2015年）》）：河南2011年~2015年烤烟烟叶化学成分中氯离子含量（0.53%-0.65%）远高于全国均值（0.26%-0.30%）。此外，根据上烟集团对豫中烟区2012-2015年氯含量测定的平均值，尤其是2014年度数据（下部叶2.21%、中部叶2.09%及上部叶2.03%），豫中烟区近几年氯离子含量都远远高于全国水平。这些统计数据表明，部分地区烟叶质量不均一性、尤其是烟叶中氯离子含量的不均一性甚至偏高特点，已成为制约浓香型烟叶品质提高的瓶颈之一。

为解决烟叶氯离子含量偏高的问题，传统改善方式多是从栽培技术入手，通过优化田间管理措施、完善调制发酵技术来稳定和提升烟叶品质。但总体而言，这些措施并未从根本上改变这些烟叶质量偏低、工业实用性不强的局面。因而使得相关改进措施缺乏较好实用性。

随着基因组学尤其是基因编辑技术的快速发展，使得人们对于烟叶中氯离子积累与相关基因之间的关系认识越来越深入。基于已有研究已经知晓的是：对于CLC（ChlorideChannel）蛋白家族，拟南芥中有7个成员，研究表明AtCLCa在驱使硝酸盐进入液泡的过程中起到关键作用，而AtCLCb就没有这种功能；其他的AtCLC分布在其他细胞区间，AtCLCd和AtCLCf可能在转运高尔基囊泡网络中起到酸化作用；AtCLCe可能参与类囊体膜的阴离子渗透性；AtCLCg与AtCLCc功能一致，参与植物盐胁迫。2010年Jossier等人在研究拟南芥CLCc时发现（The Arabidopsis vacuolar anion transporter, AtCLCc, is involved in theregulation of stomatal movements and contributes to salt tolerance，PlantJournal，2010，64 (4) :563-576），AtCLCc定位于叶片的保卫细胞，突变株对盐敏感。但总体而言，由于CLC家族蛋白功能的多样化，以及不同物种中CLC家族蛋白功能并不完全一致，因此，仅就烟草品种改良而言，针对烟草中CLC家族蛋白的功能进行深入研究可为烟草品种改良、甚至可为其他植物改良奠定良好理论基础和应用基础。

发明内容

本发明目的在于提供一个烟草氯离子通道蛋白NtCLC2（chloride channel，CLC），该基因所编码的烟草氯离子通道蛋白NtCLC2与Cl^-的吸收转运相关，基于这一功能，可为低氯离子含量的烟草新品种奠定基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。