[发明专利]红景天苷单克隆抗体的制备方法与应用

权利要求书

1.红景天苷单克隆抗体的制备方法，其特征在于：以红景天苷制备免疫抗原，免疫小鼠后获得红景天苷单克隆抗体。

2.根据权利要求1的所述的红景天苷单克隆抗体的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

完全抗原的制备：

准确称取两份红景天苷10mg于三角瓶内，分别加入20%甲醇10 mL，超声溶解；称取两份高碘酸钠5mg，加水1mL溶解，将两份高碘酸钠溶液分别加入到红景天苷溶液中，加入磁力搅拌转子，避光、室温搅拌1h，制的两份相同的红景天苷溶液；准确称取BSA、 OVA各20 mg，分别溶于2mL 0.05mol/LCBS溶液，调节pH 至9.6，完全溶解后，分别逐滴加入到两份红景天苷溶液中，匀速避光搅拌12h；剪下的透析袋pH 9.6 0.05mol/L CBS溶液预处理，将搅拌后的两种混合液转移透析袋中，透析72h，中间每间隔6h换1次透析液，获得红景天苷-BSA和红景天苷-OVA两种抗原；将经过透析处理后的两种抗原小量分装于1.5ml离心管中，-20℃冻存备用，避免反复冻融；

（2）动物免疫与效价测定：

取健康的6～8周雌性Balb/c小鼠，以红景天苷-BSA作为免疫原，初次免疫用弗氏完全佐剂乳化后，颈背部皮下多点注射，每只小鼠免疫剂量为100μg；之后每两周颈背部皮下多点注射一次加强免疫，采用弗氏不完全佐剂乳化抗原；第四次免疫使用生理盐水代替弗氏不完全佐剂，采用腹腔注射，注射剂量为100μg；通过间接ELISA检测血清效价；

（3）细胞融合及杂交瘤细胞阳性克隆筛选：

融合前三天，腹腔加强免疫，不加佐剂直接注射红景天苷-BSA抗原100μg；致死后无菌取免疫小鼠脾脏，并研磨脾脏，分散脾细胞，将细胞疏松后NH₄Cl，冰浴低渗处理，脾细胞与骨髓瘤细胞按数量之比1:5比例混合，疏松后加入37℃ 预热的1mLPEG4000进行细胞融合；融合后细胞转入含巨噬细胞的96孔细胞培养板中，加入HAT培养基进行选择培养，用间接ELISA检测抗体，选择抗体分泌阳性孔，采用有限稀释法，接种于96孔培养板内，选择单个细胞集落孔的培养上清作抗体检测，阳性者用同样方法再次克隆，直至克隆后有杂交瘤细胞生长的抗体分泌阳性率为100%；

（4）单克隆抗体的大量制备：取12周龄小鼠腹腔注射液体石蜡，1周后腹腔注射步骤3）得到的阳性杂交瘤细胞，饲料中添加同质量的葵花籽进行喂食补硒，增加腹水产量；待小鼠腹部明显隆起时收集腹水，2000r/min离心 10min，吸取上清分装，-20℃冻存。

3.如权利要求1所述的制备方法制备的红景天苷单克隆抗体。

4.如权利要求3所述的基于红景天苷单克隆抗体建立的间接竞争ELISA方法，其特征在于：用于红景天药材及其中成药、保健品中红景天苷的含量分析检测。