[发明专利]一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌的LAMP引物及其检测方法

说明书

本发明公开了一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌的LAMP引物及其检测方法，属于生物技术领域。所述的LAMP引物，包括2条外引物、2条内引物和1条环化引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑5所示。本发明提供的LAMP引物对西瓜细菌性果斑病菌的检出具有特异性，检测灵敏度达到1.72×10²fg/μL；利用本发明提供的检测方法，能够简单快速地对西瓜细菌性果斑病菌进行检测，结果肉眼可判断，且在LAMP反应前加入显色剂，大大降低了污染的可能性，适用于基层农业部门及相关检测部门的田间现场检测。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌的LAMP引物及其检测方法。

背景技术

瓜类细菌性果斑病是西瓜和甜瓜种植中危害最严重的毁灭性种传病害，病原菌是西瓜嗜酸菌Acidovorax avenae subsp.citrulli(Aac)，属世界性检疫病害。该病害自20世纪80年代中在我国报道以来，在全国大部分地区相继发生，造成的危害大、损失重，蔬果减产甚至绝收，给生产带来巨大威胁，近年已成为国内外西甜瓜生产亟待解决的突出问题，该病害已被列为我国进境检疫性有害生物和全国农业植物检疫性有害生物。

现有的检测技术主要包括传统的生理生化鉴定、Biolog全自动鉴定系统、脂肪酸鉴定、血清学检测和基于PCR方法的分子生物学检测如直接PCR、nested-PCR、荧光PCR等。但这些检测技术也存在操作复杂、耗时较长，严重依赖仪器设备且需要一定的专业操作技能等缺点，难以进行现场检测，不利于在基层和田间推广。

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是近年发展起来的应用于微生物快速检测的分子生物学技术，主要原理是利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶的链置换作用完成DNA扩增，同时释放出焦磷酸根离子，与Mg²⁺结合生成肉眼可视的白色焦磷酸镁沉淀。LAMP具有特异性强、等温高效、敏感性高、操作简单和不需要昂贵的仪器等优点，非常适合现场的快速检测，已被用于检测寄生虫、螺血吸虫、线虫、真菌、病毒和细菌等多种动植物病原。LAMP具有广阔的应用前景，目前主要的制约因素是污染造成的假阳性和引物设计要求高。

针对西瓜果斑病菌，国内外研究人员已初步建立了LAMP检测体系，但其设计引物的专化性和灵敏度都仍需提高，LAMP反应体系需要进一步完善。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性好、灵敏度高的LAMP引物，实现对西瓜细菌性果斑病菌方便、快速、准确地检测。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明通过对西瓜嗜酸菌Acidovorax avenae subsp.citrulli(Aac)与近似种的基因组序列同源性分析，寻找适合设计LAMP引物的高保守性和强特异性的基因，确定瓜类细菌性果斑病菌的编码胞外溶解结合蛋白的看家基因ugpB(登录号为Aave_0609)为该检疫性病原的靶标基因。

利用在线软件设计LAMP引物，本发明提供了一种用于检测西瓜细菌性果斑病菌的LAMP引物，包括2条外引物(F3和B3)、2条内引物(FIP和BIP)和1条环化引物(LB)，其核苷酸序列分别为：

F3：5'-TGGTGAACTTGATGCCGATG-3'(SEQ ID NO.1)；

B3：5'-ACCGGCATCACCGTCAA-3'(SEQ ID NO.2)；

FIP：5'-CGCTACGGCAAGATGATGAGCCGGGGTTGGTCCATTCCTTG-3'(SEQ ID NO.3)；

BIP：5'-CAGCCGTCGTAGATGGACTTGCACGACCTCATCCAGGAAGG-3'(SEQ ID NO.4)；