[发明专利]一种羧甲基化桑葚多糖及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种羧甲基化桑葚多糖，其特征在于：所述羧甲基化桑葚多糖是由重均分子量为20.93kDa的桑葚多糖经羧甲基化修饰后所得；所述羧甲基化桑葚多糖的重均分子量为26.18kDa，取代度为0.6-0.8。

2.权利要求1所述的羧甲基化桑葚多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)羧甲基衍生化反应：取纯化后的桑葚多糖，加入7-12倍体积的异丙醇搅拌混匀后加入10-30倍体积的NaOH溶液，搅拌，再缓慢加入7-10倍桑葚多糖重量的氯乙酸，反应3-5h，待反应结束后冷却至室温，将溶液中和至中性，得到羧甲基化衍生物；

(2)透析：将羧甲基化衍生物转移至透析袋中，先流水透析，再用蒸馏水透析，浓缩透析液；

(3)醇沉和干燥：向浓缩后的透析液中加入乙醇，进行醇沉，离心，取沉淀物用甲醇或丙酮冲洗，真空冷冻干燥，即得羧甲基化桑葚多糖。

3.根据权利要求2所述的羧甲基化桑葚多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)羧甲基衍生化反应：取300重量份的纯化桑葚多糖，加入7-12倍体积的异丙醇，在室温用磁力搅拌器搅拌30-60min后加入10-30倍体积的20％-30％NaOH溶液，室温下搅拌1-3h，缓慢加入2100-3000重量份的氯乙酸，使其在55-65℃条件下反应3-5h，待反应结束后冷却至室温，用20％-30％HCl溶液中和至中性，得到羧甲基化衍生物；

(2)透析：将羧甲基化衍生物转移至透析袋中，先流水透析12-36h，再用蒸馏水透析36-60h，减压浓缩透析液；

(3)醇沉和干燥：向浓缩后的透析液中加入乙醇，使乙醇终浓度达到80％以上，离心，用甲醇或丙酮冲洗沉淀物1-3次，真空冷冻干燥，即得羧甲基化桑葚多糖。

4.根据权利要求2或3所述的羧甲基化桑葚多糖的制备方法，其特征在于，所述的桑葚多糖按照如下方法进行提取：

①提取：取适量桑葚，匀浆，加入3-5倍重量的水，在温度80-90℃条件下提取1-2次，每次1.5-2.5h，滤过，合并滤液，减压浓缩至原体积的2/7-2/9；

②脱色：步骤①浓缩后的滤液加入适量的大孔树脂进行吸附脱色，在45-50℃下恒温振荡脱色20-40min，滤过，重复洗脱大孔树脂上的桑葚多糖，合并滤液，减压浓缩；

③除蛋白：向步骤②浓缩后的滤液中加入蛋白酶，40-70℃下，酶解蛋白，加入1-2倍体积的三氯甲烷或二氯甲烷，同时加入1/2倍体积的正丁醇，振摇20-120min，静置，除去杂质蛋白，重复3-7次直至无沉淀析出，离心，取上清液；

④醇沉：上清液中加入乙醇至乙醇终浓度为60％-90％，4℃静置12-36h，离心，取沉淀复溶，再次醇沉，重复2-3次，沉淀物用无水乙醇和丙酮各洗涤1-3次；

⑤透析：将洗涤后的沉淀物装入预先处理的透析袋中，透析；或者采用膜过滤的方法过滤，透析/膜过滤的截留分子量≥1500，干燥，即得桑葚粗多糖。

5.根据权利要求4所述的羧甲基化桑葚多糖的制备方法，其特征在于，桑葚粗多糖的纯化包括如下步骤：

①纤维素离子层析

配制8-12g·L^-1的桑葚粗多糖溶液，转入纤维素离子交换树脂柱中，用蒸馏水洗脱，流速为2-3mL·min^-1，收集洗脱液，减压浓缩，透析，真空冷冻干燥，得分级纯化的桑葚多糖；

②凝胶柱层析

将分级纯化的桑葚多糖溶于超纯水，溶液转入凝胶柱中，蒸馏水洗脱，流速为0.1-0.4mL·min^-1，收集洗脱液，减压浓缩后，真空冷冻干燥，即得桑葚多糖。

6.根据权利要求5所述的羧甲基化桑葚多糖的制备方法，其特征在于，所述纤维素离子交换树脂柱填料为DEAE-Cellulose52或DEAE-Cellulose32。

7.根据权利要求5所述的羧甲基化桑葚多糖的制备方法，其特征在于，所述凝胶柱填料为SephadexG-50、SephadexG-100、SephadexG-150或SephadexG-200。

8.权利要求1所述的羧甲基化桑葚多糖在制备保肝药物或保健品中的应用。