[发明专利]重组微生物源天然虾青素基因工程菌及其产物的制备方法

权利要求书

1.重组微生物源天然虾青素基因工程菌的制备方法，包括基因扩增、制备克隆质粒、制备重组表达质粒、制备重组微生物源天然虾青素基因工程菌，其特征在于：所述基因扩增步骤为：提取P.agglomerans的基因组DNA，PCR扩增crtE、crtB、crtI、crtY基因编码框，同时提取红法夫酵母的总RNA，逆转录成cDNA模版，PCR扩增crtS、crtR基因编码区。

2.根据权利要求1所述的重组微生物源天然虾青素基因工程菌的制备方法，其特征在于：所述基因扩增步骤中PCR反应体系为5×Phusion HF buffer 5.0ul、Template 0.1ug、dNTP(10mM)0.4ul、Phusion/Q5 DNA polymerase(2.5U/ul)0.25ul、模板DNA 2.5ng、上下游引物(10uM)各1ul、N,N-二甲基乙酰胺0.008-0.012ul、脂肪酸二乙醇酰胺0.002-0.004ul、灭菌蒸馏水加至25ul。

3.根据权利要求1所述的重组微生物源天然虾青素基因工程菌的制备方法，其特征在于：所述PCR反应参数为：98℃预变性30s，98℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃终延伸5min。

4.根据权利要求1所述的重组微生物源天然虾青素基因工程菌的制备方法，其特征在于：所述制备克隆质粒步骤为：将crtE、crtB、crtI、crtY、crtS、crtR的扩增产物分别与克隆载体pMD18T连接、转化大肠杆菌DH5α，筛选出阳性克隆，发酵后提取得到pMD18T-crtE、pMD18T-crtB、pMD18T-crtI、pMD18T-crtY、pMD18T-crtS和pMD18T-crtR克隆质粒。

5.根据权利要求1所述的重组微生物源天然虾青素基因工程菌的制备方法，其特征在于：所述制备重组表达质粒步骤为：利用同尾酶双酶切克隆质粒，验证基因序列与载体连接的方向，连接得到pMD18T-crtEBIYSR，然后将pMD18T-crtEBIYSR和pYES2载体经Hind III和Xho I双酶切连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选出阳性克隆，得到携带有虾青素合成酶基因的重组质粒。

6.根据权利要求1所述的重组微生物源天然虾青素基因工程菌的制备方法，其特征在于：所述制备重组微生物源天然虾青素基因工程菌步骤为：将重组质粒电转化导入酿酒酵母INVSc1菌株中，获得酵母工程菌。

7.重组微生物源天然虾青素基因工程菌产物的制备方法，其特征在于：所述制备方法的具体步骤为：

步骤1：将活化后工程菌接种至YPD种子培养基中培养得一级种培养物，然后将一级种培养物接种至发酵培养基中培养得二级种，备用；

步骤2：将二级种接种到发酵罐中培养，离心收集菌体，蒸馏水洗净，即得酵母菌体，备用；

步骤3：在避光的条件下，将酵母菌体中加入STET缓冲液，磁力搅拌后加入的溶菌酶，搅拌均匀后置于水浴中，随后加入细胞裂解液于沸水浴中加热，迅速冷却至室温，离心，再将上清加入到预冷的异丙醇中，混匀后沉降，离心，弃掉上清，用无菌水溶解沉淀，冷冻干燥，即得重组虾青素。

8.根据权利要求7所述的重组微生物源天然虾青素基因工程菌产物的制备方法，其特征在于：所述步骤3中溶菌酶加至其终浓度为100-120μg/mL，溶菌酶中含有溶菌酶重量0.30-0.35%的β-环糊精和溶菌酶重量0.01-0.02%的腺嘌呤核苷。

9.根据权利要求7所述的重组微生物源天然虾青素基因工程菌产物的制备方法，其特征在于：所述水浴温度为35-40℃、时间为20-30min。

10.根据权利要求7所述的重组微生物源天然虾青素基因工程菌产物的制备方法，其特征在于：所述异丙醇的添加量为上清体积的0.5-0.8倍。