[发明专利]重组鱼类干扰素的工程菌及其产物的制备方法

权利要求书

1.重组鱼类干扰素的工程菌，其特征在于：所述工程菌为具有重组鱼类干扰素基因IFN-pYES2的酿酒酵母菌株INVSc1/pYES2-GcIFN。

2.重组鱼类干扰素的工程菌的构建方法，其特征在于：所述构建方法具体包括以下步骤：

步骤1：poly I:C诱导草鱼，提取总RNA，逆转录成cDNA模版，PCR扩增，即得鱼干扰素基因GcIFN片段；

步骤2：双酶切GcIFN片段，重组入酶切的pYES2载体中，构建重组质粒pYES2-GcIFN，选取阳性克隆；

步骤3：将鉴定后的阳性克隆质粒电转化导入酿酒酵母INVSc1菌株中，获得酵母工程菌INVSc1/pYES2-GcIFN。

3. 根据权利要求2所述的重组鱼类干扰素的工程菌的构建方法，其特征在于：所述步骤1中PCR反应体系为：10×Ex Taq Buffer 5ul、dNTP Mixture(各2.5mM) 4ul、TaKaRa ExTaq(5U/ul)0.25ul、模板DNA 2.5ng、IFN-F1(20uM) 1ul、IFN-R1 (20uM) 1ul、灭菌蒸馏水加至50ul，PCR反应参数为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环，最后72℃终延伸8min。

4. 根据权利要求2所述的重组鱼类干扰素的工程菌的构建方法，其特征在于：所述步骤2中外源基因插在pYES2质粒的Hind III和Xho I酶切位点间，删除片段大小为82bp。

5.重组鱼类干扰素的工程菌产物的制备方法，其特征在于：将活化后的工程菌进行一级培养、二级培养和发酵罐培养得酵母菌体，然后将酵母菌体经细胞破碎、低温干燥、粉碎后制得的粉剂制品即为工程菌产物，所述发酵罐培养用培养基中含有天门冬氨酸。

6. 根据权利要求5所述的重组鱼类干扰素的工程菌产物的制备方法，其特征在于：所述发酵培养基成分及其重量份为：蔗糖90-110份、酵母粉25-35份、蛋白胨4-6份、尿素13-16份、麦芽汁2-4份、天门冬氨酸0.12-0.2份、KH₂PO₄ 3-5份、K₂HPO₄·3H₂O 2-3份、MgSO₄·7H₂O0.08-0.12份、ZnSO₄·7H₂O 0.002-0.003份、MnSO₄·4H₂O 0.01-0.015份、生物素0.003-0.005份。

7.根据权利要求5所述的重组鱼类干扰素的工程菌产物的制备方法，其特征在于：所述天门冬氨酸中含有0.32-0.42%的右旋天门冬氨酸。

8.根据权利要求5所述的重组鱼类干扰素的工程菌产物的制备方法，其特征在于：所述发酵罐培养步骤为：将二级种按8-12%（V/V）的接种量接种到发酵罐中，在28-32℃的条件下培养至OD600达到0.55-0.62，加入诱导终浓度为0.58-0.62mmol/L的IPTG，然后在20-30℃、200-300rpm的条件下诱导培养3-5h，离心后收集菌体，蒸馏水洗净，即得酵母菌体。