[发明专利]基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术

说明书

本发明公开了基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术，步骤包括：样品前处理和外泌体标准品的分离；链霉亲和素磁珠的活化及与生物素抗体活化；免疫磁珠与外泌体结合；外泌体核酸样品制备；电化学发光检测目的核酸序列；本发明的优点有：能对尿液、血清、唾液、细胞培养液等生物样品中的外泌体进行分离和分析；采用生物素与链霉亲和素特异性结合将抗体修饰到磁珠表面，体系稳定，避免了非特异性的干扰；体系可控，通过改变抗体类型分离纯化不同亚型的外泌体，可用于核酸表达谱研究和外泌体分型研究；终浓度可控，磁富集后再稀释或再释放获得所需浓度，便于后续检测；分离速度快，对仪器要求简单，可以同时处理多个样品。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种外泌体分离及核酸检测技术。

背景技术

外泌体含有多种核酸成分(包括dsDNA、ssDNA、mRNA、microRNA、circRNA等)可以作为有效的生物标志物应用于疾病诊断。然而外泌体在体液中的含量较低，传统方法无法直接检出。经典的超速离心分离法耗时费力，依赖于超高速离心机等大型精密设备，且难以去除相同尺度的蛋白聚合物以及其它结构。尽管，基于PEG聚沉法的外泌体快速分离试剂盒已经面市，但是，PEG同时可以聚沉病毒颗粒和大分子蛋白，其在分离外泌体中的应用备受质疑。分离纯化技术的短缺为外泌体的临床应用带来了极大挑战。因此，发展快速、高效、性能可靠的外泌体分离纯化方法对于外泌体的研究和应用具有重要意义。

传统上，外泌体核酸的检测主要通过核酸芯片和PCR技术。这些技术要么设备笨重且昂贵，要么样品处理过程复杂，并不利于临床使用和进一步普及。核酸电化学检测技术是新型的核酸检测手段，广泛运用于免疫诊断、病原微生物筛查及环境监控等领域。得益于电化学发光原理的优越性，该方法具有较宽的检测范围、高灵敏度、反应体系可控及高信噪比等特点。然而，电化学发光技术依然无法直接应用于体液外泌体核酸的检测，具体原因有：(1)生物体液成分相对复杂，游离核酸等可能会对检测造成干扰；(2)临床上可获得的生物体液有限且外泌体含量较低，裂解后目的核酸序列的浓度难以达到检测范围。综上所述，研发新型基于体液外泌体核酸的检测方法具有重要的临床意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术。

通过研究发现，免疫磁珠，如CD63抗体修饰的链霉亲和素磁珠，能够快速、高效、特异性分离纯化外泌体，经过磁富集可以将外泌体浓缩到较高的浓度范围，从而提高后续检测的灵敏度。本发明中构建基于磁富集的电化学发光检测技术，可以进一步提高灵敏度和检测效率。

为了达到上述目的本发明采用如下步骤：

基于磁富集电化学发光的外泌体核酸检测技术，包括如下步骤：

步骤一：样品收集：包括动物或人细胞培养液收集、动物或人血液样品收集、动物或人尿液样品收集、动物或人唾液样品收集；

步骤二：外泌体标准品的分离

1)样品的前处理；

2)超速离心分离外泌体标准品；

步骤三：免疫磁珠的合成：

(1)把链霉亲和素磁珠进行活化：

1)制备反应液Ⅰ分装备用；

2)将链霉亲和素磁珠母液混匀后，磁分离去除保护试剂，往EP管加入PBS混匀；

3)将EP管置于磁分离架，静置，将液体去除保留链霉亲和素磁珠；

4)重复一次步骤2-3，去除链霉亲和素磁珠的保护试剂，并将链霉亲和素磁珠溶解于1ml反应液Ⅰ获得活化的链霉亲和素磁珠。

(2)链霉亲和素磁珠与抗体结合：

1)制备反应液Ⅱ；