[发明专利]一种运用荧光聚合酶链式反应技术检测食品中过敏原榛果成分的方法

说明书

本发明公开了一种运用荧光聚合酶链式反应技术检测食品中过敏原榛果成分的方法，属于过敏原检测技术，特别是指外切酶探针荧光聚合酶链式反应技术(TaqMan)检测食品中过敏原榛果成分的方法。其技术方案是针对过敏原榛果成分序列设计引物及TaqMan探针，建立荧光聚合酶链式反应检测方法。本发明包括设计的榛果成分特异性的引物和探针以及与之配套的荧光聚合酶链式反应反应条件。本方法，与花生、麦粉、花生、栗子、松子、夏果、核桃等没有交叉反应，具有很好的特异性，检测灵敏度可达到5mg/kg。本发明所载明的方法可以用于检测食品中的过敏原，避免使用该类食物导致的过敏反应，具有实际意义。

技术领域

本发明涉及属于过敏原检测技术，具体地说是运用荧光聚合酶链式反应反应来检测过 敏原的技术，特别是食品中过敏原榛果成分的方法。

背景技术

食物过敏是人们对食物产生的一种不良反应，属于机体对外源性物质的一种变态反 应。近二十年来，食物过敏逐渐被重视，已被认为是严重的公共卫生问题，而且WHO 预测食物过敏可能成为今后最常见的流行病之一。根据美国FDA资料统计，在美国，2 ％的成年人和5％的婴幼儿患有食物过敏症，每年大约30000人需要临床紧急治疗，150 人死于食物引起的过敏反应。在所有过敏反应中，花生和树坚果过敏占10-47％。

FDA于2005年10月5日发布《食品过敏原标识和消费者保护法案-2004》(FALCPA)，规定主要食物过敏原包括树坚果等八种食物的成分。日本标签标注也要求将树坚果列为推荐标注成分。据国外有关学者应用ELISA方法结合聚合酶链式反应-ELISA法对商品进 行调查，在41种市售商品中就有27种含有过敏原榛果成分而未在标签中标识。

目前国内外对过敏原榛果成分的检测研究主要集中在ELISA、聚合酶链式反应 -ELISA、聚合酶链式反应、荧光聚合酶链式反应及生物传感器检测等方面。目前对于过 敏原的检测方法FDA和AOAC共同研究推荐使用的试剂盒有三种，均为ELISA方法。 但如果产品中蛋白质遭到破坏，ELISA方法就检测不到。而DNA比蛋白质稳定，聚合 酶链式反应方法较ELISA方法更为准确，并且避免了对大量抗体的需求，欧盟、日本和 AOAC都建议使用聚合酶链式反应方法进行确证，但没有明确特异性的引物序列。本研 究针对榛果成分rCor a1.0401DNA序列设计引物及TaqMan探针，建立了运用荧光聚合 酶链式反应技术检测食品中过敏原榛果成分的方法。

发明内容

针对上述情况，本发明克服了现有技术中的缺点，提供了运用荧光聚合酶链式反应技 术检测食品中过敏原榛果成分的方法，具体的讲就是，外切酶探针荧光聚合酶链式反应 技术(Taqman探针法)检测食品中过敏原榛果成分的方法。

其技术内容包括：使用该方法所使用的引物、探针及构建的报告质粒。其中引物、探 针的全部序列如下：

引物：

所用引物序列一：CCCCGCTGTATGTGATAT

所用引物序列二：ATGATAATACGCGATACTGTGAT

探针：

所用探针序列：TCCCGTTCTCGTCCCTGCCGT

以及由上述序列衍生出来的、差别不大于8个碱基的寡核苷酸序列以及每个序列的反 义互补序列，或它们的变体，或它们的部分序列。还包括与之配套的荧光聚合酶链式反 应反应条件。

本发明是通过以下技术方案实现的：

(1)设计特异性寡核苷酸引物、探针，将探针法探针序列三用FAM荧光基团标记，用于外切酶探针荧光聚合酶链式反应技术检测；

(2)以探针法引物序列一和探针法引物序列二作为引物，以食品中过敏原榛果成分的 相关基因DNA为模板，进行目的基因的特异性扩增；