[发明专利]基于基因编辑技术增加SMN蛋白表达的方法及其在SMA治疗中的应用

说明书

本发明提供了基于基因编辑技术增加SMN蛋白表达的方法及其在SMA治疗中的应用。增加SMN蛋白表达的方法是利用CRISPR/Cas9技术破坏SMN2的7号内含子上的剪接沉默子ISS‑N1或ISS+100而实现的。本发明提供的增加SMN蛋白表达方法是从DNA层面改造，是一种行之有效、安全高效、经济实用的方法。同时，本发明还提供了增加SMN蛋白新方法在SMA治疗中的系列应用，包括基因编辑的特定sgRNA序列，基因编辑试剂，基因编辑质粒，基因编辑细胞及其制备方法，基因编辑动物制备方法，基因编辑药物。

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地，本发明涉及基于基因编辑技术增加SMN蛋白表达的方法及其在SMA治疗中的应用。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(Spinal Muscular Atrophy；SMA)是一种常染色体隐性遗传病，主要累及脊髓前角，临床上主要表现为四肢进行性萎缩及无力，死亡率及致残率极高。在婴幼儿致死性遗传病中排名第一位，每6000名新生儿中就有一位发病。

SMA的致病基因是运动神经元生存基因(Survival motor neuron，SMN)，人类有两种高度同源的SMN基因，分别为端粒侧的SMN1和着丝粒侧的SMN2，SMN1编码全长的SMN蛋白为功能性SMN蛋白，而SMN2主要编码截短的SMN蛋白。95％的SMA病人纯合缺失SMN1基因，导致了SMN蛋白的缺乏，引起SMA相关的临床症状。

SMN1与SMN2这两个基因高度相似，最重要的差异点是位于7号外显子上的c.840CT。这种差异导致SMN2在转录过程中7号外显子大多被跳跃了(详见图1)，产生截短的蛋白，这种蛋白是低效能的，且很快被降解。有研究发现，在SMN2基因7号内含子中存在一个剪接沉默子(intronic splicing silencer，ISS)－N1即ISS-N1，这是造成7号外显子跳跃的原因之一。另一个重要的剪接抑制元件为SMN2基因7号内含子的ISS+100，它由SMN2与SMN1在7号内含子的一个差异点导致(A100G)。2011年，美国冷泉港实验室的研究人员设计了一种反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotides，ASO)SMN-Rx来掩蔽这个ISS-NI位点，从而能够调节SMN2的剪接并提高SMN蛋白的表达。然而，其制备的ASO在细胞内会降解，功能性SMN蛋白的表达是短期的。以临床SMA治疗为例，维持SMN蛋白表达需要定期不断补充ASO，这需要通过腰椎穿刺鞘内注射给药，病人难以接受，这限制了该方法的相关应用。此外，目前的ASO在美国定价每人第一年高达75万美金，以后每年37.5万美金，需要一直治疗价格高昂。

因此，亟需探究安全有效、经济实用的增加SMN蛋白表达的方法，并探索其在SMN治疗中的应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用基因编辑技术缓解或治疗脊髓性肌萎缩症的方法。

在本发明的第一方面，提供一种增加功能性SMN蛋白表达的方法，包括：利用CRISPR/Cas9技术破坏SMN2基因7号内含子上的剪接沉默子ISS-N1或ISS+100。

在一个优选例中，所述CRISPR/Cas9技术包括：采用的特定sgRNA靶向于SMN2基因7号内含子上的剪接沉默子ISS-N1或ISS+100；优选地，该特定sgRNA的序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示。

在另一优选例中，利用基于所述特定sgRNA的CRISPR/Cas9技术能在SMN2基因7号内含子上的剪接沉默子ISS-N1和/或ISS+100处引入随机的插入或缺失或者插入和缺失；优选地，在ISS-N1的两个调节区域CAG和AAAG中的至少一个引入插入、缺失、或插入和缺失的组合。

在另一优选例中，所述方法应用于人诱导性多能干细胞(hiPSCs)，包括：提供针对SMN2基因7号内含子上的剪接沉默子ISS-N1和/或ISS+100位点的sgRNA，构建靶向质粒，对hiPSC进行打靶，挑选出发生基因编辑的细胞株。