[发明专利]一种羰基还原酶突变体及其用途

说明书

本发明以半理性设计的方法对羰基还原酶ChKRED12进行分子改良，获得了酶学性能大幅度改变的突变体。其中，突变体M191S的立体选择性提高且活力提高4倍；组合突变体Q151F/M191L和Q151Y/M191L的立体选择性反转且活性提高了3倍左右。构型反转的突变体可催化获得与母本催化相反构型的手性产物，丰富了生物催化工具箱。

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程技术领域，具体内容涉及耐热性提高的羰基还原酶突变体及其用途。

背景技术

羰基还原酶(EC 1.1.1.184)，是氧化还原酶家族的一员，该酶依赖于辅酶NADH或NADPH，能够特异性催化酮(醛)、醇之间的转化。手性醇是合成手性药物的重要中间体，羰基还原酶可以高效地催化潜手性酮的还原，是制备手性醇的重要方法之一。羰基还原酶在制药工业、精细化工产业和信息工业中的应用十分广泛。

酶的催化效率和立体选择性是丈量其应用价值的重要指标，是决定生物催化过程能否实现工业化应用的关键。在实验室阶段研究的羰基还原酶通常立体选择性较好，但酶的催化活性往往不能满足工业化生产的要求。另一方面，从自然界中筛选的羰基还原酶大多数催化过程遵循Prelog规则，只能得到一种构型的手性醇。需要催化过程遵循anti-Prelog的另外一种构型往往不容易获得，因而无法满足医药、精细化学品和农用化学品等领域对该类手性醇的巨大需求。

蛋白质工程改造是提高酶活力和改变酶立体选择性的有利工具。其中，半理性设计方法的研究越来越多，该方法需对酶的分子结构和功能有一定了解，将目标位点缩小到一定水平，构建“小而精”的高质量突变体文库，从而更容易获得正向突变结果。目前，半理性设计的方法已成为蛋白质分子改造的主流方法，并广泛应用于改造酶的催化活性和立体选择性等方面。

发明内容

本发明利用半理性设计策略对来源于金黄杆菌CA49(Chryseobacteriumsp.CA49)的羰基还原酶ChKRED12(SEQ ID NO.2，NCBI登录号为：KC342012)进行分子改良，将一个或者多个氨基酸进行替换，从而获得活力和/或立体选择性改变的突变体。

所述羰基还原酶突变体是以SEQ ID NO.2为出发序列，将第151位的谷氨酰胺突变为苯丙氨酸或酪氨酸、第191位的甲硫氨酸突变为丝氨酸或亮氨酸或其任意组合得到的突变体或在此基础上增加中性突变位点得到的突变体。

根据本领域公共知识，构建的能表达上述突变体的载体、基因工程菌等也属于本发明的保护范围。

为了达到以上目的，本发明通过同源建模和酶-底物分子对接结果分析，选取母本羰基还原酶ChKRED12活性中心可能的关键氨基酸残基建立单点饱和突变文库，通过高通量筛选体系筛选突变体。

首轮分子进化获得了立体选择性反转的突变体Q151F和Q151Y，以及催化活性和立体选择性提高的突变体M191S。进一步对151和191位点进行整合，获得了立体选择性反转且活性提高的组合突变体Q151F/M191L和Q151Y/M191L。

本发明的具体方案为：

(1)同源建模和酶-底物分子对接分析：