[发明专利]用于检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性引物、试剂盒及方法

说明书

本发明属于农业技术领域，具体涉及检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性引物、试剂盒及方法。本发明合成绿色荧光蛋白基因的特异性引物，培养绿色荧光蛋白标记的绿僵菌，再通过将绿僵菌与植物共培养，验证绿浆菌在植物根中的共生性，验证方法具有灵敏度高、专属性强的特点。

技术领域

本发明属于农业技术领域，具体涉及一种用于检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性引物、试剂盒及方法。

背景技术

昆虫病原真菌能够侵染寄生昆虫，使昆虫罹病死亡，其杀虫功能已被用于植物害虫的防控治理中。近年研究发现，昆虫病原真菌除了能够侵染害虫减少植物虫害以外，还能够进入植物宿存、促进植物的发育生长。目前证明至少有8属种杀虫真菌可在植物体内定植，包括绿僵菌(Metarhizium anisopliae,M.robertsii)、白僵菌(Beauveria bassiana)、拟青霉(Paecilomyces sp.)、蜡蚧轮枝孢(Lecanicilliumlecanii)、虫草棒束孢(Isariafarinosa)、支顶孢(Acremoniumsp.)、枝孢菌(Cladosporiumsp.)、食线虫真菌(Plectosphaerella cucumerina)，还有抑制植物土传病害的粉红粘帚霉(Clonostachysrosea)等。研究发现内生的杀虫真菌与植物形成一定的互惠共生关系，例如绿僵菌提高番茄的株高、根长和生物量，促进柳枝稷和扁豆根生长发育，提高大豆的抗盐特性；白僵菌在小麦植株中定植，促进了小麦植株的生长。这些防真菌自身种群的大量繁殖并不在植物内，而是在相应的寄主虫体中。它们在植物中宿存的生物学意义深受关注，已成为近年研究热点。

不同于植物病害菌侵入植物后会大量繁殖的是，杀虫真菌在植物中通常只有少量存在，发现和检测植物内生的杀虫真菌具有较大难度。现有的检测植物内生菌的主要方法为分离培养法，即用选择性培养基分离到植物内生菌群，再进行单菌落培养，通过鉴别菌落形态和产孢结构的显微形态来鉴定类别。这种方法需要有选择性好的培养基，仅适用于可在培养基上正常生长的、在植物中存活数量较大的类群，其检测的灵敏度较低，分离过程中极易遗漏掉存活量较少的如绿僵菌的杀虫真菌。

为了确证杀虫真菌的内生性，现有技术将供试杀虫菌株加上易于检测的同位素，然后通过人工接种植物共培养，检测植物中是否存在杀虫真菌的人工标记。此法证明了在虫体与植物不接触的情况下，绿僵菌感染的病虫体上的¹⁵N被转运到植株根内，证明了绿僵菌是氮元素在昆虫与植株之间传递的桥梁。然而，同位素标记方法需要特殊的检测仪器和防护环境，过程较为繁琐，并且该实验没有给出绿僵菌菌体进入植物或存在于植物内的直接证据，因此不能排除¹⁵N通过菌体的次级代谢分泌到土壤中再被植物摄取的可能。

发明内容

为了解决现有技术中存在的不能快速、简便、准确检测植物体内的绿僵菌的问题，本发明提供一种用于检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性的引物，其具有特异性强、灵敏度高的特点。

本发明提供一种用于检测绿僵菌植物内生性的绿色荧光蛋白标记基因egfp特异性的引物。

本发明的再一目的是提供含有上述引物的试剂盒。

本发明的再一目的是提供利用上述引物检测绿僵菌在植物体内内生性的方法。

本发明的再一目的是提供上述引物对在检测绿僵菌在植物的内生性方面的应用。

本发明构建了绿色荧光蛋白基因egfp标记的绿僵菌菌株IPPMaG-58，该菌株的特征是：菌株基因组中插入了含增强型绿色荧光蛋白基因egfp的核苷酸片段，长度1024bp，其中的egfp基因能够随菌体生长过程在菌丝体和孢子中表达eGFP蛋白，该蛋白可以通过一定波长的光照激发显现荧光，即能够被观察和拍摄记录。

绿僵菌菌株IPPMaG-58中插入的绿色荧光蛋白标记基因egfp的序列(1204bp)，如SEQ NO ID 1所示：