[发明专利]检测肺癌脑转移的miRNA组合及含有该组合的试剂盒

说明书

本发明公开了检测肺癌脑转移的miRNA组合及含有该组合的试剂盒，所述miRNA组合包括miR‑10b‑3p、miR‑200c‑3p、miR‑145‑5p。所述试剂盒包括上述miRNA组合的正反向引物、外参U6 RNA的正反向引物、脑脊液RNA提取系统、逆转录试剂、PCR扩增试剂、cDNA混合阴对照品和cDNA混合阳对照品。本发明采用一组miRNA作为新的肺癌脑转移标记物，将改进单一的标记物所难以克服诊断低效能包括灵敏度和特异度等；也可避免单项检测及传统检测方法出现的漏检误判。本发明提供了采用上述miRNA组合用于肺癌预后脑转移情况辅助筛查试剂盒，不仅检测方便，且定量精确，大大提高疾病检测的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以对临床肺癌脑转移风险评估有辅助作用。

技术领域

本发明属于医学分子生物学技术领域，具体涉及检测肺癌脑转移的miRNA组合及含有该组合的试剂盒。

背景技术

近年来，随着肺癌发病率上升，诊疗技术不断发展，使患者生存期延长，肺癌脑转移的发生和诊断率也逐年升高。肺癌脑转移发生率明显高于黑色素瘤、乳腺癌、肾癌及结直肠癌，20%-65%的肺癌患者在病程中会发生脑转移，是脑转移性肿瘤中最常见的类型，其中肺腺癌发生脑转移的几率更高，占颅内转移瘤的40％-70％，隐匿性极强，其早期症状大都不明显，首发症状复杂多样，可分为两种：一种是肺癌诊断治疗后一段时间发现颅内转移；另一种先出现颅内转移，而胸部无症状。通过病理学确诊时已错过最佳治疗时间窗，影响患者的预后，导致患者生存时间显著缩短。计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）等影像学技术进行诊断也难以发现脑转移早期微小病灶，且患者受经济条件制约等因素未能接受连续的影像学检查。另有研究指出，肺癌脑转移的误诊率可高达30％-50％。首先脑血管疾病发病率远高于肿瘤脑转移，有高血压、动脉硬化的患者，肿瘤脑转移往往被忽视；其次肺癌原发灶较小或者为周围型肺癌，往往不出现呼吸系统症状，以脑转移为首发症状的肺癌，其临床表现多与脑原发性肿瘤脑血管病及脑脓肿等病相似；最后颅内转移瘤影像学的表现也多样化。。另外，由于血脑屏障的存在，致使化疗对脑转移的作用有限，恶性程度高，发展迅速。脑转移风险也随着生存的提高而上升。研究显示：局部晚期肺癌患者的生存和脑转移率呈正相关，脑转移对肺癌患者生存的危害逐渐上升。因此，随着局部和颅外远处控制的改善，对早期的肺癌患者，脑转移的早期筛查和预警至关重要。

近年来，美国国家临床生化研究院临床实验应用指南也指出应针对不同肺癌病理类型选择相应的蛋白联合抗体标记物组合；欧洲放射学会，呼吸学会也推荐7种自身抗体联合检测早期肺癌。中国肺癌脑转移诊治专家共识（2017年版）指出：腰椎穿刺及脑脊液检查脑脊液压力及细胞学检查癌细胞，或利用血清肿瘤标记物来检查抗原抗体都可作为辅助检查手段。临床资料也证实，单靠某一种标志物去诊断疾病，影响因素太多，不如联合诊断的价值大。此外，随着RNA作为肿瘤标志物的出现，提示在肿瘤发生发展过程中，RNA比受体、蛋白等出现得更早；最后，就肿瘤脑转移而言，由于血浆/血清中的RNA表达来源不明，采用血清或者血浆不能进行准确判断，而这对寻找有效的预测恶性肿瘤脑转移的标志物尤为重要。

微小RNA（miRNA）是一种小核RNA，长约22个核苷酸，不编码蛋白质，但可以与mRNA结合并在基因调控中起重要作用。大量研究表明 miRNA在肿瘤中起着促癌基因或抑癌基因的作用，在不同的恶性肿瘤中，同一条miRNA的作用可能不同。越来越多的证据支持实体肿瘤有特异的miRNA标记。单条miRNA可调控不同通路的靶基因，而单个基因也可被多个不同的miRNA调控，进而参与肿瘤的发生发展。MiRNA不仅在组织中，也在体液（血液，尿液，脑脊液）中稳定存在。脑脊液直接与中枢相连，参与脑和脊髓的物质代谢，中枢神经系统发生病变时，miRNA可从病变组织释放入脑脊液，因此脑脊液中存在大量以脑和脊髓组织为来源的miRNA，其表达改变能充分反映中枢的病变情况并且脑脊液中所含蛋白的模式比血液简单的多，miRNA 检测的干扰因素相对较少，能更好筛选标志物，便于重复和统一。

发明内容