[发明专利]兔睾丸DNA指纹鉴定试剂盒及鉴定方法

权利要求书

1.一种兔睾丸基因组DNA提取试剂,其特征在于：所述试剂之一为基因组DNA提取试剂，包含消化液 [裂解液200ul，0.5mol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA）溶液 50μl, 蛋白酶 K溶液(20mg/ml) 20μl，RNA 酶溶液 5μl]，裂解液[1mol/L Tris-盐酸溶液（pH值7.5)1ml，0.5mol/L EDTA溶液2ml，NaCI 0.58g，10%十二烷基磺酸钠（SDS）10ml，20mg/ml蛋白酶 K溶液1ml],漂洗液[5mol/L醋酸钾溶液26μl，lmol/L Tris-盐酸溶液（pH值7.5)18μl,0.5mol/LEDTA溶液( pH值 8.0) 3μl，无水乙醇 480μl，灭菌双蒸水273μl]。

2.一种兔睾丸DNA指纹图谱的PCR鉴定试剂，其特征在于：所述试剂之二为PCR鉴定试剂，包含PCR鉴定反应液总体积为23μl[2×Taq PCR Master Mix（包括Taq DNA Poly、dNTPs、Buffer）12.5μl，上游引物、下游引物(12.5μM) 各1μl,灭菌双蒸馏水8.5μl]，阳性DNA对照液[经过鉴定的正品兔睾丸提取的DNA溶液]，空白对照液[灭菌双蒸馏水]。

3.一种如权利要求1、2所述试剂用于兔睾丸DNA指纹的鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）兔睾丸基因组DNA的提取：取待测样品0.05g置 1.5ml离心管中，加入消化液275μl，裂解液250μl，充分混匀，在56℃水浴保温1 h；加到 DNA 纯化柱中，10000rpm/min离心3min；弃去过滤液，加入漂洗液600μl，10000rpm/min离心1min；弃去过滤液，重复1次；弃去过滤液，再离心2 min，将DNA 纯化柱转移入另一1.5ml离心管中，加入洗脱液100μl，室温放置5-10min后，10000rpm/min离心2min；离心管中即为模板DNA溶液，作为供试品-20℃冰箱中备用；

（2）兔睾丸PCR鉴定系统：

① 根据GenBank家兔mtDNA Cytb基因编码序列（序列号：NC_001913.1）,设计兔睾丸特异性引物，送至上海生物工程股份有限公司合成，扩增产物为326 bp，配制成12.5μM的工作液，引物序列如下：

上游引物：5′-ATGACCAACATTCGTAAACTC-3′

下游引物：5′-TCTTCATTTTAATAGGTTATA-3′

② 兔睾丸PCR反应体系：

兔睾丸鉴定反应体系：PCR鉴定反应液23μl中加入供试品DNA模板溶液2μl；

兔睾丸阳性对照反应体系：PCR鉴定反应液23μl中加入阳性DNA对照液2μl；

兔睾丸空白对照反应体系：PCR鉴定反应液23μl中加入空白对照液2μl；

③ 兔睾丸PCR反应程序

将总体积为25μl的PCR反应管置于PCR仪中，按下列程序进行：94℃预变性5min，94℃30s，退火温度59℃ 30s，72℃ 30s，25个循环，72℃延伸10min；

（3）琼脂糖凝胶检测兔睾丸DNA指纹图谱

PCR反应产物使用1.5%琼脂糖凝胶，加入核酸凝胶染色剂GelRed（终浓度0.075 μl/ml），以100bp DNA Marker作参照，在水平电泳仪上电泳，凝胶成像分析系统观察和分析结果；

结果判定

供试品凝胶电泳图谱中，在与阳性对照药材凝胶电泳图谱相应的位置上，在300-400bp有一条DNA条带为正品兔睾丸，空白对照无条带，参照图1。

4.一种如权利要求1、2、3所述试剂和方法所建立兔睾丸DNA指纹鉴定试剂盒其特征在于，包括以下部分：

如权利要求1所示的兔睾丸基因组DNA提取试剂；

如权利要求2所示的兔睾丸PCR鉴定试剂；

（3）如权利要求3所示的兔睾丸DNA指纹鉴定方法。