[发明专利]一种日本晚樱“御衣黄”品种的组织培养方法

权利要求书

1.一种日本晚樱“御衣黄”品种的组织培养方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

步骤1)外植体材料的采集与处理、表面灭菌；

步骤2)芽诱导培养；

步骤3)丛生芽增殖培养；

步骤4)根诱导培养；

步骤5)试管苗的炼苗与移栽。

2.如权利要求1所述的日本晚樱“御衣黄”品种的组织培养方法，其特征在于，步骤1)于每年3月下旬至五月上旬有阳光的午后，从日本晚樱“御衣黄”母株上剪取当年抽条的茎段3～6cm为外植体，切口用体积浓度70％酒精棉擦拭，置于灭菌过的广口瓶中带回实验室，茎段剪去叶片，茎段用流动自来水冲洗3～5min后，用3～5％加酶洗衣粉液浸泡10～15min后，用毛刷轻刷去除附着杂质，后在水龙头下用流动自来水冲洗0.5～1h，沥干，在无菌条件下利用质量浓度70％酒精浸泡，茎段浸泡15～20s后立即用无菌水冲洗2～3次，转入加有0.25mL吐温-80的质量浓度为0.1％升汞的溶液中，使外植体完全被浸没，带芽茎段浸泡10～12min，其间不断振荡以保证外植体彻底消毒，再以无菌水再次冲洗4次，沥干水分备用。

3.如权利要求1或2所述的日本晚樱“御衣黄”品种的组织培养方法，其特征在于，步骤2)经步骤1)表面灭菌后的茎段，用无菌滤纸吸干，切成1～2cm带顶芽或者一个腋芽的茎段，接入装有40mL芽诱导培养基的培养瓶中置于培养室中进行芽诱导培养。

4.如权利要求3所述的日本晚樱“御衣黄”品种的组织培养方法，其特征在于，所述芽诱导培养基配方为：MS+6-BA 1.5～2.5mg/L+IBA 0～0.3mg/L+琼脂0.7％+蔗糖4％；培养条件为：培养基pH值5.8～6.0，培养温度26±1℃，培养室湿度55±5％，光照12h/d，光强度1600～2000Lx。

5.如权利要求1或4所述的日本晚樱“御衣黄”品种的组织培养方法，其特征在于，步骤3)将步骤2)诱导出的幼嫩顶芽或者幼嫩侧芽长到1.5～2cm后，切成带单芽茎段接入丛生芽增殖培养基进行芽增殖培养。

6.如权利要求5所述的日本晚樱“御衣黄”品种的组织培养方法，其特征在于，所述丛生增殖培养基配方为：MS+6-BA 1.0～2.5mg/L+IBA 0.1～0.3mg/L+GA₃0.2～0.4mg/L+琼脂0.7％+蔗糖4％；培养条件为：培养基pH5.8～6.0，培养温度26±1℃，培养室湿度为55±5％，光照12h/d，光强度1800～2000Lx。

7.如权利要求1所述的日本晚樱“御衣黄”品种的组织培养方法，其特征在于，步骤4)经丛生芽增殖培养35d后，将株高2～3cm的健壮无根单苗，保留1～2片展开叶，接种于根诱导培养基中进行生根诱导培养。

8.如权利要求7所述的日本晚樱“御衣黄”品种的组织培养方法，其特征在于，所述根诱导培养基配方为：1/2MS+6-BA0.4～1.5mg/L+NAA 0.5～1.5mg/L+IBA 0.1～0.3mg/L+琼脂0.7％+蔗糖4％+活性炭0.25g/L；培养条件为：培养基pH 5.8～6.0，培养温度26±1℃，培养室湿度55±5％，光照12h/d，光强度1800～2200Lx。

9.如权利要求1、2、4、6-8任一项所述的日本晚樱“御衣黄”品种的组织培养方法，其特征在于，步骤5)经根诱导的试管苗根伸长至2～2.5cm时，培养瓶从培养室移入荫棚里开盖炼苗3～7d，期间湿度在85％以上、光照逐渐增加，以适应外界环境，再把试管苗从培养瓶中移出，流动自来水下清除根部附着的培养基后，用质量浓度0.1％甲基托布津浸泡1～2分钟后，移栽到事先用1～2g/L高锰酸钾溶液消毒24小时的基质中进行培养，移栽框中基质浇透水后利用遮阳网遮阴60～80％，控制温度在20～30℃、湿度在85％以上，7～10d后，逐渐转入正常管理，可获得健壮种苗；其中基质是由质量比为50％～60％的蛭石、25％～30％的泥炭土、15％～20％的珍珠岩组成，pH为5.5～6.0。