[发明专利]一种苏云金芽孢杆菌以色列亚种毒素蛋白的定量检测方法

说明书

本发明公开了一种苏云金芽孢杆菌以色列亚种毒素蛋白的定量检测方法，它是在现有苏云金芽胞杆菌毒素蛋白含量测定方法的基础上，通过采用特殊的样品预处理方法，解决了试样中杂质干扰毒素蛋白定量检测的问题，同时对SDS–PAGE凝胶配方进行了优化，进一步改善了凝胶电泳图谱中两种蛋白带的迁移率、分辨率和蛋白带形态，使测得的结果更加准确。本发明能用于Bti类产品的质量控制，具有操作简单易行、快速、成本低、受外界环境影响小等优点。

技术领域

本发明属于毒素蛋白的定量检测领域，具体涉及一种苏云金芽孢杆菌以色列亚种毒素蛋白的定量检测方法。

背景技术

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)，是目前应用最广泛的一种微生物杀虫剂，它的主要杀虫成分是伴孢晶体，苏云金芽胞杆菌以色列亚种(Bacillusthuringrensis subsp.Israelensis，简称Bti)是Goldberg和Margalit于1977年发现的一种对蚊科幼龄害虫具有高度毒力的病原细菌，主要有效成份也是伴孢晶体，由多种毒素蛋白组成，其中分子量为128KD和65KD的两种毒素蛋白是主要成分。

Bt类产品的质量检测与控制，目前最有效的方法是生物测定，但因生物测定受靶标昆虫质量、数量及外界条件等影响，检测误差高达40％。Bt类产品的毒素蛋白含量测定在我国国标与化工行业标准中均采用SDS-PAGE凝胶电泳方法，如HG 3617-1999的化工行业标准中报道的苏云金杆菌可湿性粉剂的毒素蛋白含量测定方法，用碱性溶液处理苏云金杆菌原粉伴孢晶体，使其降解为毒素蛋白，然后通过SDS-PAGE，依蛋白质相对分子质量的差异，使毒素蛋白与其它杂蛋白分离，之后用薄层扫描仪或电泳图像扫描仪扫描蛋白区带面积，进行定量。该方法能测出苏云金芽胞杆菌中分子量为130KD的毒素蛋白含量，但目前还没有同时测出苏云金芽胞杆菌以色列亚种中分子量为128KD和65KD的两种毒素蛋白含量的方法报导。

申请人曾尝试参照Bt可湿性粉剂标准HG 3617-1999中毒素蛋白的检测方法来检测Bti中晶体蛋白含量，结果发现随着Bti试样取样量的增加，Bti毒素蛋白含量越来越低，甚至不出现晶体蛋白条带，说明用现有的Bt毒素蛋白的检测方法无法准确定量Bti毒素蛋白，因此迫切需要建立一种准确度高、受外界影响因素小的Bti类产品晶体蛋白含量测定方法，从而更好地控制Bti类产品的质量。

发明内容

本发明的目的是针对苏云金芽胞杆菌以色列亚种中毒素蛋白含量测定的空白，提供一种能准确测定苏云金芽胞杆菌以色列亚种中分子量为128KD和65KD的两种毒素蛋白含量的方法。

本发明提供的方法包括以下步骤：

1)取苏云金芽孢杆菌以色列亚种待测样品，加入pH为7-9、浓度为0.05-0.2mol/L的磷酸缓冲液，充分混匀后离心，弃去上清，再加入水，充分混匀后离心，弃去上清；

2)向收集到的菌泥中加水，充分悬浮，然后再加入氢氧化钠溶液使氢氧化钠终浓度达0.1mol/L，摇匀，静置后再加入样品稀释液，于沸水浴中加热5-10min，冷却后离心，取上清，配制成样品溶液；

3)配制SDS-PAGE，加入样品溶液，进行凝胶电泳操作；

4)电泳后的胶片经固定、染色、漂洗、脱色、成像，根据蛋白带区域的强度值计算含量。

优选地，所述磷酸缓冲液的pH为8.0、浓度为0.1mol/L。