[发明专利]一种犬干扰素α生物学活性检测方法

权利要求书

1.一种犬干扰素α生物学活性检测方法，其包括以下步骤：

采用PCR扩增获取犬Mx蛋白的Mxp的基因片段；

用PCR扩增获得的犬Mx蛋白的Mxp的基因片段通过T4DNA连接酶替换原pEGFP-N1载体质粒中的pCMV的基因片段，构建pEGFP-N1-Mxp质粒；

用pEGFP-N1-Mxp质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株；

对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养；

以梯度稀释的犬干扰素α标准品制备标准曲线，确定干扰素效价与荧光值之间的数学逻辑关系；

将待检犬干扰素α样品加入克隆化培养后的细胞中，然后检测荧光强度，结合标准曲线评价待检犬干扰素α样品的效价。

2.根据权利要求1所述的犬干扰素α生物学活性检测方法，其特征在于，采用PCR扩增获取犬Mx蛋白的Mxp的基因片段的步骤包括：

根据Genebank中已公布的犬Mx蛋白的基因序列，选择5'端含有ISRE反应元件的启动子区域，设计PCR引物，进行PCR扩增；

然后通过双酶切后，再通过切胶回收纯化获得Mxp的基因片段。

3.根据权利要求1所述的犬干扰素α生物学活性检测方法，其特征在于，用PCR扩增获得的犬Mx蛋白的Mxp的基因片段通过T4DNA连接酶替换原pEGFP-N1载体质粒中的pCMV的基因片段，构建pEGFP-N1-Mxp质粒的步骤包括：

去除pEGFP-N1载体质粒的pCMV的基因片段；

通过T4DNA连接酶用Mxp的基因片段替换原pEGFP-N1载体质粒中的pCMV的基因片段，构建重组质粒pEGFP-N1-Mxp；

转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，摇菌，提取重组质粒，通过DNA测序获得重组质粒的Mxp片段的DNA序列，选择正确序列的重组质粒；

所述正确序列如序列1所示。

4.根据权利要求1所述的犬干扰素α生物学活性检测方法，其特征在于，用pEGFP-N1-Mxp质粒转染细胞，并通过新霉素筛选出稳定转染细胞株的步骤包括：

通过转染试剂将pEGFP-N1-Mxp质粒转染至细胞，转染96h后，换成含2μg/mL新霉素的完全培养基持续培养14日，筛选出具有新霉素抗性的细胞，即为稳定转染细胞株。

5.根据权利要求1所述的犬干扰素α生物学活性检测方法，其特征在于，所述克隆化培养为将筛选出的稳定转染细胞株通过有限稀释培养法培养，从而获得单个细胞形成的克隆；

优选的，在对筛选出的稳定转染细胞株进行克隆化培养的步骤中还包括对克隆后的细胞进行检测，通过PCR鉴定细胞基因组中是否含有Mxp基因。

6.根据权利要求1或2所述的犬干扰素α生物学活性检测方法，其特征在于：Mxp的基因片段序列为序列1所示。

7.根据权利要求3所述的犬干扰素α生物学活性检测方法，其特征在于：去除pEGFP-N1载体质粒的pCMV的方法为双酶切法。

8.根据权利要求1或4所述的犬干扰素α生物学活性检测方法，其特征在于：所述细胞为MDCK细胞。

9.根据权利要求1所述的犬干扰素α生物学活性检测方法，其特征在于：所述的犬干扰素α标准品为公布号为CN106282279A的专利所揭示的一种重组犬干扰素α标准品、其制备方法及效价测定方法制备得到的重组犬α干扰素。

10.权利要求1-9任一项所述的犬干扰素α生物学活性检测方法在对天然或重组犬干扰素α进行生物学活性检测中的应用。