[发明专利]一种EB病毒DNA的定量检测方法

说明书

本发明公开一种EB病毒DNA定量检测的方法，涉及生物检测的技术领域。本发明提供的EBV DNA定量检测方法，是采用核酸释放剂快速裂解、释放样本中的EBV‑DNA，对血浆样本、外周血样本、咽拭子样本以及阴性阳性对照采取不同的提取方式，配以PCR反应液等组分，在荧光定量PCR仪上，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过荧光信号的变化实现EB病毒DNA的定量检测。根据EBV DNA的准确报告值，能够对EB病毒进行定性定量的确定，该方法具有快速、准确、操作方便等优点。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体是指一种EB病毒DNA的定量检测方法。

背景技术

EB病毒(EBV)又称人类疱疹病毒4型(HHV-4)，epstein和barr于1964年首次成功地将burkitt非洲儿童淋巴瘤细胞通过体外悬浮培养而建株，并在建株细胞涂片中用电镜观察到疱疹病毒颗粒。EB病毒感染人体时，首先在口咽上皮细胞内增殖，然后感染B淋巴细胞，这些细胞大量进入血液循环而造成全身性感染，并可长期潜伏在人体淋巴组织中，当机体免疫功能低下时，潜伏的EB病毒活化形成复发感染。因此，检测EB病毒的含量对疾病的筛查和辅助诊断具有重要意义。

近年来EB病毒检测方法的相关研究主要是ELISA检测方法和EB病毒DNA检测方法，前者检测特异性低，假阳性高，后者使用实时荧光定量PCR检测EB病毒DNA，但是现在的方法一般是使用单一目标区域的定性或定量分析，这样检测的准确性和特异性往往不高。目前出现一种将多重PCR与TaqMan荧光探针技术结合起来实现对EB病毒的定性和定量分析，但此方法对引物的设计至关重要，引物的优劣直接影响PCR的特异性与灵敏度，从而影响检测结果的准确度。

发明内容

本申请解决的主要问题是提供一种对EBV-DNA实时荧光PCR检测方法，操作方便、快速，标准明确，分析结果准确，能对检测结果进行定量分析。通过实时荧光PCR检测EBV-DNA含量，解决了现有检测方法成本高、实践操作效果不佳、标准不明确、检测结果分析不准确等技术问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供的检测方法包括以下步骤：

(1)试剂配制：

A、在试剂制备区内将试剂盒内各组分取出，室温融化后，离心数秒；

B、设所需要的的管数为n，管数n＝样本数+1管阴性对照+1管空白对照+1管高值质控品+1管低值质控品+4管阳性参考品，另由于分装的消耗需增加N/15(若N/15＜1按1计算)。按照PCR反应液：酶混合物：内标＝38:2:1的比例配制反应液。

C、算好各试剂的使用量，加入到适当体积试管中，充分混匀，向设定的n个PCR反应管中分别加入40μL，转移至样本处理区；

(2)样本处理：

A、血浆样本

取离心管加入浓缩液；

取待测血浆样本、质控品各100μL，分别加到离心管中；振荡混匀，离心；

吸弃上清，沉淀中加入核酸释放剂，振荡混匀，静置。

B、外周血样本：

向离心管中加入1000μL红细胞裂解液，混匀外周血样本，取300μL外周血样本加入到离心管中，充分振荡混匀，静置，离心，吸弃上清；

再加入950μL红细胞裂解液，充分振荡混匀，离心，吸弃上清；向离心管中加入950μL生理盐水，漩涡至透明清亮，离心，吸弃上清；

向沉淀中加入核酸释放剂，将沉淀振荡混匀，静置。

C、咽拭子样本：

向咽拭子样本收集管中加入1mL生理盐水，振荡混匀，将全部咽拭子样本液体倒入离心管中；