[发明专利]人源化CD28基因改造动物模型的制备方法及应用

权利要求书

1.一种人源化小鼠动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化小鼠动物模型基因组中包括嵌合CD28基因，所述的嵌合CD28基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示，该人源化小鼠动物模型体内可表达人源化CD28蛋白，同时内源CD28的蛋白表达降低或缺失。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述嵌合CD28基因编码人源化CD28蛋白，所述人源化CD28蛋白的组成包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，所述嵌合CD28基因编码的胞内参与信号传导的部分为小鼠来源，所述嵌合CD28基因编码的胞外区域包含人CD28蛋白胞外域的部分片段，同时该小鼠来源部分和人源部分通过序列拼接连接于小鼠动物模型内源的Cd28启动子后。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述小鼠来源部分包括Cd28基因的1号外显子全部序列、2号外显子部分序列、3号外显子部分序列及其后所有外显子的全部序列。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行CD28人源化小鼠动物模型的构建，所述基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术或归巢核酸内切酶。

5.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，将小鼠来源的Cd28的2号外显子至3号外显子的部分序列替换为人源CD28的2号外显子至3号外显子部分序列，使用sgRNA靶向的5’端靶序列如SEQ ID NO：4所示，靶向的3’端靶序列如SEQ ID NO：17所示。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述人源化CD28蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示。

7.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述嵌合CD28基因编码权利要求6所述的人源化CD28蛋白，或所述的嵌合CD28基因选自下列组中的一种：

a）CDS序列为SEQ ID NO：31所示的序列；

b）转录的mRNA序列为SEQ ID NO：32所示的序列；

或c）来源于人CD28基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：35所示的序列。

8.一种靶向载体，其包含：a）与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂；b）插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；c）与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂；所述供体DNA序列为人CD28基因的核苷酸序列，所述的人CD28基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：35所示，所述的待改变的转换区位于Cd28基因的2号外显子至3号外显子，所述5’臂序列如SEQ ID NO：34所示；所述3’臂序列如SEQ ID NO：36所示。

9.一种构建人源化小鼠动物模型的载体，其特征在于，所述载体包含sgRNA，用于敲除或替换Cd28基因的2号外显子至3号外显子的部分，所述sgRNA靶向的5’端靶序列如SEQ IDNO：4所示，sgRNA靶向的3’端靶序列如SEQ ID NO：17所示。

10.一种权利要求8所述的靶向载体、权利要求9所述的载体在敲除或替换CD28基因的2号外显子至3号外显子的部分中的应用。

11.一种CD28基因人源化细胞株，其特征在于，所述人源化细胞株基因组中包括嵌合CD28基因，所述的嵌合CD28基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示，该人源化细胞株可表达人源化CD28蛋白，同时细胞株内源CD28的蛋白表达降低或缺失，所述的细胞株来源于小鼠，所述的细胞株不能发育为个体。