[发明专利]产生人胸苷激酶1（TK1）特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株及其应用

说明书

本发明涉及两种可产生TK1特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株、两种TK1特异性单克隆抗体、制备方法及其在制备TK1免疫检测试剂中的应用。本发明通过杂交瘤技术，制备了杂交瘤细胞株1D3和2F6，分泌人TK1特异性单克隆抗体。两株抗体能进行配对和检测TK1蛋白，初步建立了检测人TK1的双抗体夹心ELISA方法。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，并且更具体地，涉及到两种可产生TK1特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株、两种TK1特异性单克隆抗体、制备方法及其应用。

背景技术

胸苷激酶1（thymidine kinase 1，TK1），也称为细胞质胸苷激酶，是线粒体胸苷激酶（又称肌苷激酶2，thymidine kinase 2，TK2）的同工酶。TK1催化胸苷（TdR）磷酸化为胸苷一磷酸（TMP），进而形成的胸苷三磷酸（TPP），为DNA合成提供必需的脱氧核苷酸原料，是DNA合成的关键酶之一。

TK1的表达与多种肿瘤细胞增殖紧密相关。在肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、骨肉瘤和前列腺癌等多种癌细胞中TK1表达水平不同程度升高。因此TK1表达水平能直观反映肿瘤细胞增殖速率，可实现动态、连续和评估，是一种是国际公认的优选肿瘤广谱标志物。目前认为，TK1检测的临床应用价值体现在：①动态监控手术放化疗效果；②独立的肿瘤预后评估因子；③更早评估肿瘤复发风险；④评估各类增殖疾病恶变风险。另外TK1检测在健康体检方面也有较好的应用价值，包括：①早期发现体内的恶性增殖状况，具有早期性；②筛查出进展期癌前病变，预防肿瘤发生。

有相关流行病学调查结果表明，人体外周血中TK1浓度在2 pM以下提示体内细胞增殖度正常；若在2 pM以上，则提示体内存在细胞异常增殖，包括炎症、脂肪肝、胆结石、乳腺增生、前列腺增生、消化道溃疡、肿瘤等，需要予以关注、进一步全面检查或者定期复查等。

目前临床和科研工作中对TK1的检测包括检测组织切片中的TK1和检测外周血中的TK1。前者通过免疫组化的方式实现，后者则通过各种免疫学检测方法实现，包括固相酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫化学发光等，其中酶免疫点印迹化学发光法，可以实现对外周血、细胞培养上清等标本中的TK1的高灵敏度、高特异性定量分析，应用尤为广泛。

无论是基于免疫组化的定性/半定量分析，还是基于ELISA和免疫化学发光的定性/定量分析，都离不开高质量的TK1特异性抗体。目前行业内应用的TK1特异性抗体有多克隆抗体和单克隆抗体，前者主要是来自鸡的IgY，后者主要是来自于小鼠的IgG；从免疫原性方面，主要是应用TK1蛋白中的免疫原性多肽（表位肽），包括羧基端的多肽和氨基端的多肽，免疫鸡或者小鼠得到抗体；部分抗体是应用全长的TK1蛋白作为免疫原，但这些TK1蛋白均为体外原核重组表达而成。至于以体外真核重组表达的全长TK1蛋白作为免疫原制备的TK1特异性抗体尚未见报道。

根据生物信息学分析，人TK1蛋白中存在较多的糖基化、磷酸化和乙酰化等翻译后修饰靶点，这就导致了原核重组表达的TK1与真核表达的TK1在分子组成、分子结构上存在一定差异。因此，采用真核重组表达TK1蛋白，更好地代表真核细胞中TK1的天然分子状态，将其作为免疫原免疫动物，制备抗体，将有利于提升抗体制备的效率、抗体识别天然TK1蛋白的特异性和亲和力。

发明内容

本发明针对上述问题，目的在于提供两种可产生TK1特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株、两种TK1特异性单克隆抗体、制备方法及其应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一方面，本发明公开了两种可产生TK1特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株（1D3）和（2F6），其分别于2018年5月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO:C2018106；于2018年5月10日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC NO:C2018105。保藏地址为：中国武汉武汉大学。