[发明专利]一种抗H7N9抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种抗H7N9抗体及其制备方法和应用，所述抗体的重链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述抗原结合片段的轻链可变区的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的抗体与H7N9‑HA的亲和力在nM级别，中和活性高于已知的广谱抗体FI6，制备方法标准可控、成本低廉、简单高效、适于标准化生产，为疫苗研制提供了新的思路。

技术领域

本发明属于生物医药和免疫学技术领域，涉及一种抗H7N9抗体及其制备方法和应用。

背景技术

流感是威胁人类健康的主要因素之一，H7N9、H5N6和H10N8等禽流感病毒引起的人感染禽流感，发病严重、死亡率高，给人类健康、经济发展和社会稳定带来严重的影响。治疗流感的措施主要包括疫苗和抗病毒药物，其中，疫苗是预防流感病毒感染最有效的方式之一，但对突发的新亚型流感病毒株缺乏保护作用；抗病毒药物在耐药病毒株产生之前具有治疗作用，感染后期治疗效果不明显。目前的抗病毒药物包括M2离子通道蛋白抑制剂和神经氨酸酶(NA)抑制剂，例如金刚烷胺和奥司他韦，这些药物虽然能够有效地抑制病毒复制，但容易造成耐药株的出现。流感康复者的血清中含有高滴度的抗体，能够有效救治流感临床重症者，然而上述抗体获取难度大，效价不均一，难以应对大范围的流感爆发。

抗体的体外生产技术十分重要，目前常用的单克隆抗体筛选方法主要有噬菌体展示技术、酵母展示技术、B细胞永生化技术和单细胞PCR技术等。

噬菌体展示技术最初由美国Smith博士在1985年提出，噬菌体编码的蛋白基因通过插入外源的DNA片段，使外源基因的表达蛋白与噬菌体的外壳蛋白相融合，展示在噬菌体的表面。该技术最常用的载体为溶原性的丝状噬菌体，例如M13、fI和fd，噬菌体的基因组为单链环状DNA，外部被外壳蛋白g8p包裹。噬菌体抗体库主要具有以下优势：不依赖于人或动物的免疫反应，适应于大规模工业化生产，能够快速筛选出10⁸以上的噬菌体抗体库，可以获得不同亲和力的抗体。在噬菌体抗体库的构建过程中，抗体的重链与轻链基因会发生重组，这个过程模拟了机体中抗体亲和力的成熟过程。

酵母展示技术由KD Wittrup实验室建立，2001年转让给Abbott实验室，目前已广泛应用于蛋白质工程领域。这项技术是分离和改造抗体的有力手段，当抗体的重链可变区和轻链可变区由linker链接成单链可变区抗体(scFv单链抗体)后，与酵母表面细胞壁上的Aga2p蛋白融合，并与标记荧光素的抗原结合，该项技术通过FACS分选有结合活性的酵母细胞，进行抗体的体外细胞表达。

B细胞永生化技术最初由EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)介导转化，以提高细胞的增殖能力和分泌抗体的活性，目前该项技术已经被广泛应用于单克隆抗体的制备和B细胞研究中。Corti等在研究T淋巴细胞、B淋巴细胞的应答过程中，运用了B淋巴细胞永生化技术和高通量细胞筛选技术，得到了具有较强增殖能力和抗体分泌活性的记忆B淋巴细胞。

单细胞PCR技术是一种体外克隆和表达单个抗原特异性B细胞抗体基因的技术，该技术需要的细胞少、效率高、基因多样性好，通过重链和轻链的随机重组可以建立10⁷-10¹²库容量的抗体序列，并筛选到亲和力强的抗体，适用于有丰富抗原特异性B细胞的人群，在新发突发传染病领域具有广阔的应用前景。然而，单细胞PCR技术仍然存在一些缺陷。

例如在猕猴浆母细胞抗体的筛选过程中，由于中国猕猴与印度猕猴在表型和基因组上具有巨大差异，通过单细胞PCR实验得到的重链的扩增效率达65％以上，但轻链的扩增效率低于40％，总体的克隆效率不高；另外，由于中国猕猴基因组的测序质量不高，有大量gap存在，难以找出有效的V基因序列设计引物进行单细胞PCR扩增。目前有报道的扩增引物效果不理想，多套引物混合使用可以提高扩增效率，但扩增工作量大，难度大。

因此，建立一种效率较高、操作简便的方法制备亲和力强的流感病毒抗体，在免疫学领域具有重要意义。

发明内容