[发明专利]癌症特异性TCR及其分析技术和应用

权利要求书

1.一种T细胞的单细胞转录组TCR分析方法，所述方法包括如下步骤：(1)获得单个的T细胞；(2)构建每个T细胞的cDNA文库并测序，获得每个细胞每个基因的表达量；(3)鉴别单个T细胞的TCR序列和克隆性识别，其特征在于：在进行步骤(3)的分析时，对步骤(2)获得的生物信息数据进行比对和质量控制，去除低质量的部分；

对于cDNA的测序读段数据质量控制的方法为：保留符合以下条件的测序读段：①未知碱基占给定读段总序列不超过10％，②Phred质量值低于5的碱基不超过50％，③不含有接头序列；

对于细胞质量控制的方法为，去除数据量和数据质量低的细胞，保留符合以下条件的细胞：①CD3D的TPM大于3；②当分离CD4⁺T细胞时，CD4的TPM需要大于3，同时CD8的TPM小于30；③分离CD8⁺T细胞时，CD8的TPM需要大于3，同时CD4的TPM小于30；④线粒体基因上的读段占所有读段的比例不高于10％；其中TPM值的定义为：

其中C_ij表示为基因i在细胞j中的读段的数量；

对用于分析的单细胞的基因表达量的质量控制方法为：当一个基因在所有细胞中被检测到的读段平均数量大于1才用于后续分析。

2.如权利要求1所述的方法，在步骤(3)中使用软件TraCeR进行单个T细胞的TCR序列识别，比较任意两个细胞中的TCRɑ和TCRβ的序列，当两个细胞中至少一种TCRɑ同时至少一种TCRβ的序列完全一致时，且一致的TCRɑ和TCRβ的序列是可以翻译成有效蛋白质的，且TCRɑ的TMP值至少大于10和TCRβ的TMP值至少大于15，这样的两个细胞被认为来自同一克隆。

3.如权利要求1或2所述的方法，步骤(2)中采用Smart-Seq2构建每个T细胞的cDNA文库并测序，获得每个细胞每个基因的表达量。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，采用Smart-seq2法反转录时，采用如下的反转录条件：

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，采用Smart-seq2法对PCR扩增产物纯化时，用磁珠进行两次纯化，第一次纯化时，所加入的磁珠体积与PCR扩增产物体积相同，第二次纯化时，所加入的磁珠体积为PCR扩增产物体积的2倍。

6.一种预测TCR，MHC和小肽段结合能力的计算方法，其特征在于包括如下步骤：

1)获得癌症患者肿瘤免疫细胞的TCR的RNA序列，患者的MHC类型，以及小肽段的序列，输入RosettaDock软件；

2)根据已知序列和蛋白质结构数据库，对TCR序列进行蛋白质结构的同源建模；

3)确认TCR中CDR的6个loop区，并进行分步模拟，计算出所述6个loop区的结合自由能；

4)将MHC，TCR和小肽段结合在一起，分别进行低分辨率以及高分辨率的对接进程计算，达到最大迭代次数终止计算；

5)分析结果，RMSD，计算对接自由能和表示结合能力强弱的打分函数值Rosettascore；

其中，步骤1)中，采用权利要求1-5任一项所述的T细胞的单细胞转录组TCR分析方法，获得癌症患者的肿瘤免疫细胞的TCR的RNA序列。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤1)中，采用外显子测序方法并运行optitype得到患者的MHC类型。

8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤1)中，采用NetMHC以及RNA测序技术，预测患者体内的小肽段序列。

9.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤3)中，根据小肽段的氨基酸残基计算出小肽段的主链中心，依据RosettaDock软件识别出TCR的CDR的loop区，计算各loop区与小肽段主链中心的距离，选择距离最近的6个loop区。