[发明专利]一种未使用缓冲液电转化感受态细胞的制备方法

说明书

本发明提供了一种未使用缓冲液电转化感受态细胞的制备方法，属于细菌分子遗传学技术领域，包括以下步骤：将大肠杆菌接种于含有镁离子的液体培养基中进行第一培养；将得到的第一培养物与液体培养基混合，再进行第二培养，将得到的第二培养物进行离心分离，得到沉淀；将沉淀与水混合，待沉淀悬起后进行离心分离，得到沉淀；将沉淀与水混合，待沉淀悬起后进行离心分离，得到沉淀，重复操作1次，得到沉淀；将沉淀与水混合，待沉淀悬起后进行离心分离，得到沉淀；将沉淀与水混合，待沉淀悬起后，与二甲基亚砜混匀，得到电转化感受态细胞。采用本发明的制备方法能够获得高转化率的感受态细胞且操作简单、制备成本低。

技术领域

本发明属于细菌分子遗传学技术领域，具体涉及一种未使用缓冲液电转化感受态细胞的制备方法。

背景技术

大肠杆菌经过处理后可以摄取外源DNA，处于这种状态的细胞称为“感受态细胞”，感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其转化效率的高低直接影响到后续实验工作的进行。常用的感受态细胞制备方法有CaCl₂法、Hanahan和Inoue法。目前，常规方法制备的感受态细胞，制备过程需要特定的缓冲液，如常规选用的缓冲液成分为：每20mL的TB转化缓冲液由如下成分组成:12.5mL的双蒸水、4mL的lmol/L的KCl、2.4mL的0.45mol/L的MnCl₂、0.5mol/L的CaCl₂0.6mL和0.5mL的0.5mol/L的K-MES缓冲液，缓冲液不但配制繁琐，而且成本高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种未使用缓冲液电转化感受态细胞的制备方法，在不使用缓冲液的条件下，不仅减少了成本，而且能够提高感受态细胞的转化率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种未使用缓冲液电转化感受态细胞的制备方法，包括以下步骤：

1)将大肠杆菌接种于含有镁离子的LB液体培养基中进行第一培养，得到第一培养物；

2)将所述步骤1)得到的第一培养物与LB液体培养基混合，至OD₆₀₀值为0.08～0.10时进行第二培养，至OD₆₀₀值为0.35～0.40时，得到第二培养物；

3)将所述步骤2)得到的第二培养物进行第一离心分离，弃去上清液后得到第一沉淀；所述第一离心分离的时间为15～25min；

4)将所述步骤3)得到的第一沉淀与水混合，待所述第一沉淀悬起后进行第二离心分离，弃去上清液后得到第二沉淀；所述第二离心分离的时间为10～20min；

5)将所述步骤4)得到的第二沉淀与水混合，待所述第二沉淀悬起后进行第三离心分离，弃去上清液后得到第三沉淀；所述第三离心分离的时间为5～15min；

6)重复步骤5)1次，得到第四沉淀；

7)将所述步骤6)得到的第四沉淀与水混合，待所述第四沉淀悬起后进行第五离心分离，弃去上清液后得到第五沉淀；所述第四离心分离的时间为5～15min；

8)将所述步骤7)得到的第五沉淀与水混合，待所述第五沉淀悬起后，与二甲基亚砜混匀，得到电转化感受态细胞。

优选的，所述步骤1)LB液体培养基中镁离子的浓度为0.005～0.015M。

优选的，所述步骤8)将第五沉淀悬起所需水与二甲基亚砜的体积比为(1129～1222):(85～92)μl。

优选的，所述步骤1)第一培养的条件包括：所述第一培养的温度为30～42℃，所述第一培养的转速为200～280rpm，所述第一培养的时间为10～14h。