[发明专利]罗湖病毒（TiLV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂

说明书

本发明公开了一种罗湖病毒（TiLV）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、逆转录酶、重组聚合酶和对照品。本发明的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到10fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种罗湖病毒的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。

背景技术

罗湖病毒(Tilapia Lake Virus，TiLV)，是近年来发现并报道的一种新兴病毒，该病毒最早于2009年在以色列发现，目前已经在哥伦比亚、厄瓜多尔、埃及、以色列和泰国得到确认。虽然该病原体不会引起公共卫生问题，但可以导致受感染种群大量死亡。据报道，该病毒具有较强的传染性，已经给以色列、厄瓜多尔、埃及等国养殖的罗非鱼造成大面积死亡，死亡率高达70％。

据联合国粮农组织发布的消息，罗湖病毒有可能比目前已知的分布范围更广，给全球罗非鱼养殖造成严重威胁，目前已经引起多个国家的重视并进行积极的监视。罗湖病毒是一种负链RNA病毒，基因组由10个独立的基因片段组成，目前仍未确定其分类地位，极有可能是正粘病毒科的一种新型病毒，罗湖病毒在24-33℃均可以生长，最适生长温度25℃。2017年5月，我们首次从国内养殖的罗非鱼中检测出该病毒。鉴于罗湖病毒引起的高死亡率和重大经济损失，为了及早发现养殖罗非鱼是否被罗湖病毒感染，有必要建立一种快速、准确、灵敏的检测方法。

目前，尚缺乏有效控制罗湖病毒的药物和方法。目前TILV检测方法主要是RT-PCR方法。虽然PCR方法敏感、准确、快速，可替代病原学检测，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。与一般PCR技术相比，荧光PCR检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。但实时荧光PCR耗时长，成本较高，目前在水产养殖动物的常规病原体检测中的应用还不多。本发明建立了RAA恒温荧光来检测罗湖病毒的方法，快速方便，准确可靠，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国海洋养殖及其产品的贸易有重要作用。

重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供罗湖病毒(TILV)的RAA恒温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

一种罗湖病毒(TILV)核酸的检测试剂盒，包括：罗湖病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述罗湖病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述罗湖病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ IDNO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。