[发明专利]鲤春病毒血症病毒（SVCV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂

说明书

本发明公开了一种鲤春病毒血症病毒（SVCV）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、逆转录酶、重组聚合酶和对照品。本发明的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到0.1fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种鲤春病毒血症病毒的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。

背景技术

鲤春病毒血症(Spring viraemia of carp，SVC)是一种以出血为主要临床症状并伴有高度传染性的急性流行病，其病原为鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carpvirus，SVCV)鲤春病毒血症病毒(SVCV)，又名鲤弹状病毒，属弹状病毒科(Rhabdoriridae)，水泡病毒属(Vesiculorirus)。病毒粒子90nm～180nm,宽60nm～90nm，有类脂囊膜，核衣壳中空，螺旋状对称，直径50nm。病毒基因组为单股、负链、不分节段的RNA，长约11019个核苷酸，主要包含5个基因。病毒粒子浮力密度在CsCl中为1.195g/ml～1.200g/ml，在15％～60％的蔗糖溶液中为1.16g/ml，在5％～25％的蔗糖梯度中沉降系数为38s～40s。病毒的抵抗力不强，感染性受环境因子的影响较大，对酸、热及脂溶剂敏感，pH值7～10时稳定，在13℃～22℃均可生长，最适生长温度为17℃。

鲤春病毒血症病毒破坏鱼体内的水盐平衡，鲤鱼急性感染时，在临床上表现为病鱼无目的的漂游，体发黑，腹部肿大。皮肤和鳃渗血，无外部溃疡及其他细菌病症状。消化道出血，可见到腹水严重带血；肠炎、心、肾、鳔有时连同肌肉也出血，内脏水肿。肝部血管有血管炎及水肿。最后导致血管坏死，肝实质也多处坏死。

目前，尚缺乏有效控制鲤春病毒血症病毒的药物和方法。国际上通行的控制该病的有效措施是进行鲤春病毒血症的监测，及早发现并进行隔离或扑杀。目前SVCV检测方法主要包括核蛋白基因特异性探针原位杂交、免疫组织化学、ELISA方法和核蛋白基因RT-PCR方法等。例如：基于组织病理学的方法不仅操作繁琐、费时，而且灵敏度较低；基于免疫学的方法虽然具有敏感性高、检测快速等特点，可用于大批标本的检测，但对新鲜样品进行检测时出现的假阳性问题在一定程度上还限制着该方法的广泛应用；而PCR方法敏感、准确、快速，可替代病原学检测，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。与一般PCR技术相比，荧光PCR检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。但实时荧光PCR耗时长，成本较高，目前在水产养殖动物的常规病原体检测中的应用还不多。LAMP等温扩增技术同样由于假阳性较高，准确度低，水产病原检测中的应用还是比较局限。本发明建立了RAA恒温荧光来检测鲤春病毒血症病毒的方法，快速方便，准确可靠，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国海洋养殖及其产品的贸易有重要作用。

重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。

发明内容