[发明专利]一种牡蛎疱疹病毒的间接原位杂交PCR检测方法

说明书

本发明是一种牡蛎疱疹病毒的间接原位杂交PCR检测方法，属于基因工程技术领域，包括如下步骤：首先将待检测样品固定，脱水，包埋制备成组织切片，并配制液相PCR反应体系、通过PCR反应程序，对组织切片中原位固定的靶DNA进行扩增，再将特异性探针与扩增后的组织切片进行原位杂交，最后通过免疫酶标技术在显微镜下对检测结果进行判断，如果出现蓝紫色阳性信号，则表示该样品的牡蛎疱疹病毒检测结果为阳性并可对病毒做到精确定位。其优点是：本发明结合普通液相PCR方法灵敏度高和原位杂交方法可以实现组织定位的优点，从而达到对牡蛎疱疹病毒的灵敏、特异检测和精确定位。该检测方法可用于贝类各时期养殖过程中的牡蛎疱疹病毒的跟踪检测，具有很高的使用价值。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种通过间接原位杂交聚合酶链式反应（indirect in-situ PCR, Indirect ISPCR）检测牡蛎疱疹病毒（Ostreid herpesvirus1,OsHV-1）的方法。

背景技术

自20世纪90年代初以来，OsHV-1引起包括我国在内的全球13个国家和地区海水养殖双壳贝类的大规模死亡。目前已知受影响的宿主物种包括牡蛎（6种），扇贝（2种），蛤类（2种）和魁蚶在内的11个物种；其中受影响最严重的是我国养殖的栉孔扇贝（Chlamys farreri）和欧洲养殖的长牡蛎（Crassostrea gigas）。建立准确、灵敏和精确定位的检测方法是及早发现病原并采取相应防控措施前提和基础。

目前对于OsHV-1的检测，最常用的方法是聚合酶链式反应（PCR）技术；PCR所采用的引物多是基于病毒基因组C区设计的，并被OIE推荐为该病毒普通PCR检测的通用方法，目前被多个国家和地区广泛采用。PCR检测方法具有灵敏度高和特异性强的优点，但由于其取样过程需要破坏组织结构才能提取DNA，因此检测结果中无法得到病原在不同组织部位和细胞类型中的分布信息。原位杂交检测方法虽然可以弥补PCR检测方法无法定位的缺点，但该检测方法灵敏度较低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：克服普通PCR和原位杂交检测方法存在的技术缺陷，将PCR技术和原位杂交技术结合起来，首先对组织切片中原位固定靶组织的DNA进行液相PCR，然后进行杂交和显色；既保持了两项技术的优势又弥补了各自的不足。本发明所述检测方法可用于双壳贝类各时期养殖过程中OsHV-1的跟踪及组织定位检测。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：1）探针制备：以OsHV-1阳性样本DNA为模板，采用C2/C6引物，经PCR 扩增制备探针；2）采用常规动物组织固定，脱水，包埋，切片等方法，将待检测的样品制备成组织切片并对其进行消化；3）以预混好的PCR反应体系对步骤2）的组织切片靶DNA进行间接原位扩增；4）取步骤3）间接原位扩增后的组织切片预杂交与杂交进行预杂交与杂交；5）取步骤4）杂交后的组织切片充分洗涤与抗体孵育； 6）通过免疫酶标技术对步骤5）组织切片显色，复染，显微镜观察，如果组织中出现蓝紫色信号检测结果为阳性。

具体包括如下步骤：

步骤1）DNA探针制备：以OsHV-1阳性样本的DNA为模板，采用C2/C6引物经PCR扩增，引物信息如下：

C2：5＇- CTCTTTACCATGAAGATACCCACC -3＇、

C6：5＇- GTGCACGGCTTACCATTTTT -3＇、