[发明专利]细菌视紫红质的可溶化表达载体及其表达方法

说明书

本发明公开了一种细菌视紫红质的可溶化表达载体及其表达方法。所述载体将除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA整合到pET28a质粒中得到pET28a‑ΔspMBP载体；将截短的人类载脂蛋白cDNA整合到pET28a‑ΔspMBP载体中得到pET28a‑ΔspMBP‑ApoAI*‑His载体；将细菌视紫红质合成基因整合到pET28a‑ΔspMBP‑ApoAI*‑His载体中，得到细菌视紫红质的可溶化表达载体。本发明的细菌视紫红质的可溶化表达载体，实现了天然含量极少的细菌视紫红质的大量表达，达到全蛋白的40％左右，同时提高了细菌视紫红质的可溶性且表达的蛋白没有形成包涵体。

技术领域

本发明属于蛋白表达载体技术领域，涉及一种细菌视紫红质的可溶化表达载体及其表达方法。

背景技术

光敏蛋白是存在于细胞膜上的一类感光蛋白，当其受到光刺激时能够改变细胞膜内外的阴阳离子浓度从而改变膜电位，控制细胞信号和内外离子浓度等功能，现已作为光遗传学手段中的重要工具。细菌视紫红质是其中研究较早的一种蛋白，对于其结构与功能的联系的探究很有意义。但是从生物组织中提取的细菌视紫红质量非常少，若要达到一定的剂量用于研究成本很高。根据文献1(POMPEJUS M,et al.High‐yield production ofbacteriorhodopsin via expression of a synthetic gene in Escherichia coli[J].The FEBS Journal,1993,211(1‐2):27-35.)，在大肠杆菌中表达的细菌视紫红质以包涵体形式存在，其天然构象被破坏，而且表达量并不是特别高，后续探究仍很困难。因此使细菌视紫红质大量表达将为后续研究提供便利。文献2(Mizrachi D,et al.Making water-soluble integral membrane proteins in vivo using an amphipathic proteinfusion strategy[J].Nature communications,2015,6:6826.)提出了融合表达的策略来表达膜蛋白，但是其使用的OspA诱导蛋白对于膜蛋白的表达量的提高并不是特别明显。

发明内容

本发明的目的在于提供一种细菌视紫红质的可溶化表达载体。该载体以pET28a质粒作为骨架，在细菌视紫红质N端连接了去除信号肽的麦芽糖结合蛋白作为诱导蛋白，在细菌视紫红质C端连接截短的人载脂蛋白A1包裹细菌视紫红质的脂溶性表面，在一定程度上提高细菌视紫红质的表达量，并增强了融合蛋白的水溶性。

实现本发明目的的技术方案如下：

细菌视紫红质的可溶化表达载体，所述的载体为pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His，其以pET28a质粒为骨架，依次整合除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA即ΔspMBP，ΔspMBP连接细菌视紫红质N端基因序列，细菌视紫红质C端基因序列连接截短的人载脂蛋白cDNA即ApoAI*。

本发明还提供上述细菌视紫红质的可溶化表达载体的构建方法，该方法首先PCR扩增pMBP-p质粒，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA即ΔspMBP，将ΔspMBP整合到pET28a质粒中得到pET28a-ΔspMBP载体；PCR扩增pET28a-ApoAI质粒，得到截短的人类载脂蛋白cDNA即ApoAI*，将ApoAI*整合到pET28a-ΔspMBP载体中得到pET28a-ΔspMBP-ApoAI*-His载体；PCR扩增密码子优化过的细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin,bR)合成基因，将其整合到pET28a-ΔspMBP-ApoAI*-His载体中，得到细菌视紫红质的可溶化表达载体pET28a-ΔspMBP-bR-ApoAI*-His，具体步骤如下：

步骤1，先将pMBP-p质粒进行PCR扩增，得到除去N端信号肽的麦芽糖结合蛋白cDNA即ΔspMBP(SEQ.NO.(7))，用NcoⅠ限制性核酸内切酶和NdeⅠ限制性核酸内切酶对ΔspMBP和pET28a质粒进行酶切，连接反应得到pET28a-ΔspMBP载体；