[发明专利]一种获得海藻糖合成酶突变体的方法及其应用

说明书

本发明公开了一种获得海藻糖合成酶突变体的方法及其应用。具体是对来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)的海藻糖合成酶活性位点附近的氨基酸进行饱和突变，以含有葡萄糖的麦芽糖溶液为底物，快速筛选海藻糖得率高的突变体酶。用此方法获得的突变体酶包括第286位的组氨酸突变为谷氨酰胺H286Q，第286位的组氨酸突变为天冬酰胺H286N和第339位的谷氨酸突变为精氨酸E339R。突变体酶能够利用常规生物工程的方法制备，并用于海藻糖的生产。本发明利用快速检测方法筛选海藻糖合成酶突变体，获得的突变体酶能够大幅降低葡萄糖对海藻糖合成酶活性的抑制作用，提高海藻糖合成酶转化效率，有很高的利用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体是一种获得海藻糖合成酶突变体的方法及其应用，及用此方法获得的能提高海藻糖转化率的海藻糖合成酶突变体，并将得到的海藻糖合成酶用于制造海藻糖。

背景技术

海藻糖是由两分子葡萄糖以α,α-1,1-糖苷键相连而成，在自然界中广泛存在的天然性二糖。它自身性质非常稳定，并对多种生物活性物质具有保护作用。近年来，研究发现海藻糖能广泛应用于各类食品的鲜味保持及质地改善。随着社会的进步和人们生活水平的提高，人们对食品的质量和口感日趋重视，这增加了人们对海藻糖的需求。因此，大规模的廉价高效生产海藻糖具有极大的经济价值，同时也将更能推广和普及海藻糖在食品领域的使用。

研究已发现自然界中有多种酶系能够合成海藻糖。其中一种是在许多微生物中都能发现的海藻糖合成酶(Trehalose Synthase)。此酶能够将麦芽糖直接转化成为海藻糖，比较适宜应用于工业化生产海藻糖。来源于脂肪杆菌弯曲高温单孢菌(Thermomonosporacurvata)的海藻糖合成酶(tcTreS)能够高效的将麦芽糖转化成为海藻糖。然而，tcTreS除了能够可逆催化麦芽糖分子内转糖基生成海藻糖外，还有微弱的水解麦芽糖生成葡萄糖的功能。过高的葡萄糖含量能够抑制海藻糖的生成。目前，尚无将来源于脂肪杆菌弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)的海藻糖合成酶进行分子改造，降低葡萄糖的抑制作用，提高海藻糖转化效率的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种获得海藻糖合成酶突变体的方法及其应用，该方法是通过对来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)的海藻糖合成酶活性位点附近的氨基酸进行饱和突变，筛选海藻糖得率高的突变体酶；利用常规生物工程的方法制备性能优异的突变体酶，并用于海藻糖的生产。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

获得一种来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)的海藻糖合成酶的突变体，其特征在于，第286位的组氨酸替换为谷氨酰胺H286Q，或第286位的组氨酸替换为天冬酰胺H286N，或第339位的谷氨酸替换为精氨酸E339R；

来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)的海藻糖合成酶的序列如SEQ ID NO.1所示。

获得上述的海藻糖合成酶突变体的方法，是对来源于弯曲高温单孢菌(Thermomonospora curvata)的海藻糖合成酶活性位点附近的氨基酸进行饱和突变，以含有葡萄糖的麦芽糖溶液为底物，用DNS方法检测产物快速筛选海藻糖得率高的突变体酶；

所述的海藻糖合成酶活性位点附近的氨基酸包括第280位的谷氨酸，第286位的组氨酸，第335位的甲硫氨酸和第339位的谷氨酸；

将上述的海藻糖合成酶突变体基因转入宿主细胞，然后利用该宿主细胞进行常规发酵生产海藻糖合成酶；

上述的宿主细胞为常规基因工程表达宿主细胞，包括大肠杆菌细胞和枯草芽孢杆菌细胞。

以麦芽糖浆或淀粉浆为原料，通过常规酶法转化生产海藻糖的方法，用上述海藻糖合成酶的生产方法得到的海藻糖合成酶制造海藻糖。