[发明专利]一种高加索三叶草与白三叶的五倍体杂交种苗及其组织培养扩繁方法

说明书

本发明提供了一种高加索三叶草与白三叶的五倍体杂交种的组织培养扩繁方法，属于育种领域。其培养方法包括：以五倍体杂交种无菌苗的茎段作为外植体，接种至诱导培养基上进行不定芽的诱导培养；将诱导得到的幼小不定芽接种至继代培养基上进行继代培养；继代培养后将得到的不定芽丛块接种于分化培养基中进行分化培养，至再生苗长至2.5～4cm后，将其分成单株并接入生根培养基中进行生根培养。采用此组织培养扩繁方法，可以在短期内成功获得大量的五倍体杂交种植株，保证之后回交、育性恢复试验中材料的充足供应，为培育能够在内蒙古干旱、寒冷地区种植的三叶草新品种提供技术支撑。

技术领域

本发明涉及育种领域，具体而言，涉及一种高加索三叶草与白三叶的五倍体杂交种苗及其组织培养扩繁方法。

背景技术

三叶草是豆科车轴草族(Trifolieae)三叶草属(Trifolium)的一年生或多年生牧草。对于美国、新西兰等发达国家，没有三叶草几乎就没有其发达的现代草地农业及畜牧业。在我国内蒙古的大部分地区，由于受干旱和寒冷双重逆境的影响，可直接栽培或放牧利用的三叶草几乎难以生存。

白三叶(T.repens L.)是三叶草属多年生草本植物，在内蒙古仅生长于大兴安岭林区的局部地段。长期的自然选择，使其具备了抵抗-30℃低温的能力，但必须在冬、春有足够积雪的地区生存。高加索三叶草(T.ambiguum Bieb.)是三叶草属中唯一具有地下根茎并可通过此根茎进行无性繁殖的多年生长寿命型牧草，其抗寒、抗旱性强，但根瘤菌特殊化，在高加索以外地区不能结瘤固氮。此二种三叶草具有相同的染色体基数(8)，在遗传学上具有一定的亲缘关系，通过远缘杂交，可以培育在内蒙古地区种植并结瘤固氮的杂交种。但是由于亲缘关系较远，且染色体倍性具有差异(白三叶为四倍体，高加索三叶草为六倍体)，二者的杂交种染色体倍性主要表现为五倍体。众所周知，单倍体植株不育，无法获得后代种子。因此，亟待提供一种五倍体杂交种的组织培养扩繁方法，以期获得大量的后代植株，为之后的回交、育性恢复试验提供材料及技术支撑。

发明内容

本发明的目的是提供一种高加索三叶草与白三叶的五倍体杂交种的组织培养扩繁方法，以克服五倍体杂交种不育以至无法获得后代植株的问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种高加索三叶草与白三叶的五倍体杂交种的组织培养扩繁方法，其包括：

以杂交种无菌苗的茎段作为外植体，接种至诱导培养基上进行诱导培养，将诱导得到的幼小不定芽接种至继代培养基上进行继代培养；

继代培养后将得到的不定芽丛块接种于分化培养基中进行分化培养，至再生苗长至2.5～4cm后，将其分成单株并接入生根培养基中进行生根培养。

进一步地，诱导培养基是由MS培养基附加2.5～3.5mg/L的6-苄氨基嘌呤、0.25～0.35mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸以及23～28g/L的蔗糖、6～7.5g/L的琼脂形成的。

进一步地，继代培养基是由MS培养基附加2.5～3.0mg/L的6-苄氨基嘌呤、0.25～0.35mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸以及23～28g/L的蔗糖、6～7.5g/L的琼脂混合形成的。

进一步地，诱导培养基与继代培养基培养的条件均为：pH值5.8～6、环境温度26～28℃、日照时间10～12h、光照强度18000～22000μmol·m^-2·s^-1、培养时间25～35d。

进一步地，继代培养的次数为1～2次。

进一步地，分化培养基是由MS培养基附加2.5～3.5mg/L的6-苄氨基嘌呤、0.2～1.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸以及27～33g/L的蔗糖、6～8g/L的琼脂混合形成的。