[发明专利]携带HER2/ERBB突变抗原基因的重组腺相关病毒载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体，通过切除腺相关病毒基因中病毒包装识别位点内的全部基因，插入HER2/ERBB抗原基因，定点突变，替换CMV启动子，得到HER2/ERBB Y1191/1192G突变的重组腺相关病毒载体；其中，突变位点为1191和1192位，由酪氨酸突变为甘氨酸，所述病毒包装识别位点内的全部基因为Rep和Cap致病基因，替换CMV启动子的启动子为p5启动子，beta启动子或SV40启动子。

2.一种含有权利要求1所述携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原的重组腺相关病毒载体的产品，包括重组腺相关病毒质粒和被重组腺相关病毒载体/颗粒感染或转染的细胞系。

3.制备权利要求1所述携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原的重组腺相关病毒载体的方法，包括以下步骤：

1)改建AAV 2型pAAV-GFP质粒：使用限制性内切酶BsaBI和XbaI将AAV 2型pAAV-GFP质粒中的病毒包装识别区域内基因切除，保留原本的CMV启动子，得到pAAV-GFP酶切片段；

2)PCR法得到HER2/ERBB抗原的DNA；

3)将步骤2)中HER2/ERBB抗原的DNA进行错位PCR，之后和步骤1)产物pAAV-GFP酶切片段进行DNA连接反应，得到携带CMV启动子和HER2/ERBB抗原基因的质粒；

4)利用点突变方法改变致癌相关的氨基酸；

5)将CMV启动子用酶切连接的方法替换为β-肌动蛋白启动子、SV40早期启动子或p5启动子，得到携带β-肌动蛋白启动子、p5启动子或SV40早期启动子的重组腺相关病毒载体。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述步骤3)中包括以下步骤：

1)从表达HER2/ERBB的肿瘤组织获取总mRNA，由总mRNA进行逆转录反应，合成总cDNA；

2)以所述总cDNA为模板，在引物1：atgcccatctggaagtttccagatgaggag和引物2：gactctagatcacactggcacgtccagac的引导下进行PCR扩增，得到的HER2/ERBB抗原的DNA。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述步骤4)的操作方法为：

使用引物3：cagcccagccttcgacaacctcggtggctgggaccaggacccaccag进行点突变PCR，将HER2基因突变为HER2 Y1191/1192G突变抗原基因。

6.一种含有携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变抗原基因的重组腺相关病毒载体的产品，其特征在于：包括HER2/ERBB Y1191/1192G突变重组腺相关病毒的质粒载体，HER2/ERBBY1191/1192G突变重组腺相关病毒的病毒载体、被所述HER2/ERBB突变重组腺相关病毒的载体感染或转染的细胞系；所述HER2/ERBB突变重组腺相关病毒的的质粒载体由权利要求1所述的或者权利要求3～5任一项所述的构建方法制得的携带HER2/ERBB Y1191/1192G抗原基因的重组腺相关病毒载体制得；所述HER2/ERBB Y1191/1192G突变重组腺相关病毒的病毒载体由所述HER2/ERBB Y1191/1192G突变重组腺相关病毒的质粒载体和重组腺相关病毒包装辅助质粒pAAV-RC2和pAAV-Helper进行细胞培养得到。

7.一种权利要求1所述的携带HER2/ERBB Y1191/1192G突变重组腺相关病毒的病毒载体或者权利要求2所述相关的产品在制备治疗HER2/ERBB抗原阳性的癌症或癌前病变药物中的应用。