[发明专利]一种通过细胞表面标记特异性富集的人牙根尖乳头干细胞亚群及其干性检测方法

权利要求书

1.一种通过细胞表面标记特异性富集的人牙根尖乳头干细胞亚群，其特征在于，所述干细胞为人牙根尖乳头干细胞，所述细胞表面标记选自CD18，STRO-1，CD106/VCAM-1，CD146/MUC-18，HOP-26，CD49A/整合素β1，SB-10/CD166中的一个或多个。

2.权利要求1所述的人牙根尖乳头干细胞亚群，其特征在于，以CD18作为细胞表面标记，所述CD18使用荧光标记或磁珠标记。

3.一种权利要求1或2所述人牙根尖乳头干细胞亚群的富集方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

步骤1，收集正常的成人拔除智齿，立即置于4℃预冷的含50-300U/mL青霉素、50-300μg/mL链霉素、和1-5μg/mL二性霉素B的α-MEM培养基中，2℃-8℃条件下运至洁净实验室，所述成人年龄为19到29岁，从收集到开始提取牙根尖乳头干细胞的时间间隔不超过72小时；

步骤2，转移至生物安全柜，取出智齿至培养皿，用4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液清洗，即PBS清洗其外表面；步骤3，用无菌手术刀轻轻从牙根部切下根尖乳头，切碎；

步骤4，将牙根尖乳头组织置于含1-10 mg/ml I型胶原酶和1-10 mg/ml分散酶的PBS中，37℃消化30min；

步骤5，将消化液通过70微米的细胞筛过滤，获得含有人牙根尖乳头干细胞的单细胞悬液，900rpm离心5min，用PBS洗细胞一次；

步骤6，用PBS重悬细胞，加入CD18单抗，混匀，室温避光孵育30分钟；

步骤7，洗涤后，900rpm离心5min，用PBS重悬细胞；步骤8，通过流式细胞仪分选或免疫磁珠分选，获得CD18阳性干细胞亚群。

4.一种权利要求1或2所述人牙根尖乳头干细胞亚群的干性检测方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

步骤1，取富集的CD18阳性干细胞亚群，计数；

步骤2，900rpm 离心5min；

步骤3，用含10％-20% 胎牛血清、50μM-200μM的抗坏血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的α-MEM培养基重悬细胞；

步骤4，将10⁴个CD18阳性干细胞接种于T25细胞培养瓶中，置于37℃、5％ CO₂的孵箱中培养；

步骤5，每3-4天换液，14-16天后，倒掉培养液，PBS清洗贴壁细胞，随后用含有0.1%甲苯胺蓝和2%多聚甲醛的PBS溶液进行固定、染色。

5.一种权利要求1或2所述人牙根尖乳头干细胞亚群的干性检测方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：

步骤1，取富集的CD18阳性干细胞亚群，计数；

步骤2，900rpm 离心5min；

步骤3，用含10％-20% 胎牛血清、50μM-200μM的抗坏血酸2-磷酸酯、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的α-MEM培养基重悬细胞；

步骤4，将步骤3得到的细胞以10⁴每孔接种于12孔板中，置于37℃、5％ CO₂的孵箱中培养；

步骤5，培养1-2天后，加入Brdu试剂，所述Brdu试剂，孵育24h；

步骤6，Brdu染色试剂盒对细胞进行染色；苏木素复染；镜下计数阳性干细胞数，测定所述干细胞的增殖率。