[发明专利]获得无标记转基因植物的方法

说明书

本发明公开了一种获得无标记转基因植物的方法。该方法通过CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统实现，CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统的载体中包含基因编辑蛋白基因、靶向载体自身的sgRNA和特异时空表达基因启动子，特异时空表达基因启动子在愈伤组织时期不表达，待完成遗传转化后表达基因编辑蛋白基因。应用本发明的技术方案，操作简单，主要针对农作物或经济植物，尤其是多年生，无性繁殖的植物，通过剪切载体本身，产生大片段转基因成分的丢失，意义重大。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种获得无标记转基因植物的方法。

背景技术

目前，转基因技术广泛的用于基因功能的研究，随着商业化转基因植物新品种的不断出现,人们对转基因植物安全性问题的争论和担忧日益增加。CRISPR/Cas9技术是新兴的基因编辑工具，可以在特定位点产生DSB，借由生物体对DNA的修复过程中，可能产生插入、缺失、替换等现象，从而定点获得突变体，随着基因编辑技术的不断优化，CRISPR/Cas9技术用于基因敲除已经相当完善，但是Cas9系统产生靶向敲除之后对于植物本身的生长发育并没有改善，反而是Cas9的存在增加了脱靶的概率，对于商品生产来说是不稳定因素。对于一年生植物来说在生殖过程中存在一定的几率自然分离掉marker基因/Cas9编码基因，但是自然发生的概率相当小不能应用于生产中，且对于多年生经济作物来说，很难得到无转基因成分植株。目前人们通过转座途径、染色体内同源重组、目标基因与标记基因共转化、位点专一性重组等措施来剔除外源基因。

本发明基于目前广泛应用的CRISPR/Cas9技术，以特异表达启动子(愈伤组织不表达)驱动Cas9表达，并且除原有敲除位点之外，在T-DNA插入序列两端额外设计两个靶位点，经农杆菌介导转化后，在特异时期表达的Cas9蛋白通过靶向敲除靶点在植物基因组产生突变，同时T-DNA出去边界靶点，经过Cas9剪切也产生DSB，使得T-DNA插入序列从基因组上去除，产生非转基因突变体植株。随着基因敲除技术的广泛应用，构建突变体库用于基因研究，但是由于基因敲除得到的突变体存在一定的安全问题，国家对于转基因的界定还不明朗，对于基因敲除构建的转基因突变库的应用在生产育种中显得不太方便，并且通过转基因植物自体繁殖分离转基因成分效率低下，且对于多年生植物，以及无性繁殖的植物来说不能分离转基因成分。本发明可以经过一代获得不含Cas9蛋白，标记基因等外源序列的突变体，方便快捷。

发明内容

本发明旨在提供一种获得无标记转基因植物的方法，以解决现有技术中，以解决现有技术中获得无标记转基因植物操作繁琐的技术问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种获得无标记转基因植物的方法。该方法通过CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统实现，CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统的载体中包含基因编辑蛋白基因、靶向载体自身的sgRNA和特异时空表达基因启动子，特异时空表达基因启动子在愈伤组织时期不表达，待完成遗传转化后表达基因编辑蛋白基因。

进一步地，启动子具有如LOC_Os07g01820所示的核苷酸序列。

进一步地，基因编辑蛋白基因为Cas9基因或Cpf1基因。

进一步地，载体还包含配套的Cas9基因或Cpf1基因的元件。

进一步地，载体为双元表达载体。

进一步地，双元表达载体为Pcambia 1300。

进一步地，植物包括水稻、小麦、马铃薯、红薯、杨树和柑橘。

应用本发明的技术方案，操作简单，主要针对农作物或经济植物，尤其是多年生，无性繁殖的植物，通过剪切载体本身，产生大片段转基因成分的丢失，意义重大。

附图说明